一种粪污噬菌体DNA的提取方法、提取粪污噬菌体DNA的试剂盒及该试剂盒的应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种粪污噬菌体DNA的提取方法，该方法采用超滤浓缩法和硅胶吸附柱法相结合，即首先采用超滤浓缩器浓缩纯化噬菌体，然后再采用硅胶吸附柱法提取噬菌体DNA。本发明专利技术还公开了利用前述粪污噬菌体DNA的提取方法提取粪污噬菌体DNA的试剂盒及该试剂盒的应用。本发明专利技术的优点在于，通过对现有技术的改进，结合100‑kDa超滤浓缩器和硅胶吸附柱可以在5h内获得浓度约为53.47ng/μL的粪污噬菌体DNA，本发明专利技术提供的粪污噬菌体DNA的提取方法不仅缩短了提取时间，且提取的DNA浓度和纯度较好，满足后期qPCR和宏基因组测序要求。

A Method for Extracting Fecal Phage DNA, a Kit for Extracting Fecal Phage DNA and Its Application

The invention belongs to the field of biotechnology, and discloses a method for extracting bacteriophage DNA from feces. The method combines ultrafiltration concentration method with silica gel adsorption column method, that is, the bacteriophage is first concentrated and purified by ultrafiltration concentrator, and then the bacteriophage DNA is extracted by silica gel adsorption column method. The invention also discloses a kit for extracting bacteriophage DNA from fecal sewage by the above-mentioned method and the application of the kit. The invention has the advantages that, by improving the existing technology, the fecal contamination phage DNA with a concentration of 53.47 ng/mu L can be obtained in 5 hours by combining the 100_kDa ultrafiltration concentrator and the silica gel adsorption column. The method for extracting the fecal contamination phage DNA provided by the invention not only shortens the extracting time, but also has good concentration and purity of the extracted DNA. Late qPCR and metagenomic sequencing requirements.

【技术实现步骤摘要】
一种粪污噬菌体DNA的提取方法、提取粪污噬菌体DNA的试剂盒及该试剂盒的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种粪污噬菌体DNA的提取方法、提取粪污噬菌体DNA的试剂盒及该试剂盒的应用。
技术介绍
肠道微生物群落是耐药基因的天然储存库，动物粪污中含有较丰富的耐药基因。噬菌体是一类以细菌为宿主的病毒，是耐药基因水平转移的重要载体，因此，提取噬菌体DNA是研究粪污DNA中耐药基因的种类和丰度的关键。Natureprotocols中详细介绍了从粪污样品中提取噬菌体DNA的方法，利用CsCl密度梯度离心对粪污获得的噬菌体原液进行纯化，再通过甲酰胺/CTAB法提取噬菌体DNA[Thurber,R.V.H.,MatthewBreitbart,MyaWegley,LindaRohwer,Forest,Laboratoryprocedurestogenerateviralmetagenomes.NatureProtocols,2009.4(4):470-483]。另一种噬菌体DNA提取方法是Quirós[Brown-Jaque,M.,Calero-Cáceres,W.,Espinal,P.,Rodríguez-Navarro,J.,Miró,E.,González-López,J.J.,Cornejo,T.,Hurtado,J.C.,andF.Navarro,Muniesa,M.,Antibioticresistancegenesinphageparticlesisolatedfromhumanfaecesandinducedfromclinicalbacterialisolates.InternationalJournalofAntimicrobialAgents,2018.51(3):434-442]和Colomer-Lluch等[Colomer-Lluch,M.,Imamovic,L.,Jofre,J.,Muniesa,M.,Bacteriophagescarryingantibioticresistancegenesinfecalwastefromcattle,pigs,andpoultry.AntimicrobAgentsChemother,2011.55(10):49008-49011.]利用100-kDa超滤浓缩器对噬菌体原液进行纯化浓缩，然后通过苯酚/氯仿抽提法提取DNA。上述的两种方法中，CsCl密度梯度离心法对设备要求高，且离心时间长；甲酰胺/CTAB法和苯酚/氯仿抽提法提取DNA也都比较耗时，且甲酰胺、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)和苯酚/氯仿都是对人体有害的溶剂。目前，急需开发一种可快速便捷粪污提取噬菌体DNA方法或试剂盒。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术目的在于提供一种粪污噬菌体DNA的提取方法、提取粪污噬菌体DNA的试剂盒及该试剂盒的应用。本专利技术所采用的技术方案为：一种粪污噬菌体DNA的提取方法，该方法采用超滤浓缩法和硅胶吸附柱法相结合，即首先采用超滤浓缩器浓缩纯化噬菌体，然后再采用硅胶吸附柱法提取噬菌体DNA。具体的，上述粪污噬菌体DNA的提取方法，包括以下步骤：(1)超滤浓缩法浓缩纯化噬菌体：对粪污进行预处理，得到滤液，利用100-kDa超滤浓缩器对滤液进行浓缩，得到浓缩液；(2)硅胶吸附柱法提取噬菌体DNA，具体包含以下步骤：S1:向所述浓缩液中加入DNaseI，反应后加入EDTA灭活DNaseI，得到中间液一；S2:向所述中间液一中加入蛋白酶K裂解噬菌体，反应，离心，取上清，得到噬菌体裂解液上清；S3:向所述噬菌体裂解液上清中加入DNA结合液，混匀，加入乙醇，混匀，得到中间液二，将中间液二移入吸附柱，离心，去滤液，得到吸附柱一；S4:向吸附柱一中加入去蛋白液，离心，去滤液，得到吸附柱二：S5:向吸附柱二中加入漂洗液，离心，去滤液，得吸附柱；S6:重复步骤S5；S7:向吸附柱中加入TE洗脱液，离心，得到滤液，即所述粪污噬菌体DNA。具体的，上述粪污噬菌体DNA的提取方法，所述结合液包含8mol/L盐酸胍，20mmol/LTris-HCl，所述结合液的pH为6.5。具体的，上述粪污噬菌体DNA的提取方法，所述去蛋白液包含4mol/L盐酸胍，20mmol/LTris-HCl和乙醇，所述乙醇在所述去蛋白液中的体积百分数为70％，所述蛋白液的pH为6.5。具体的，上述粪污噬菌体DNA的提取方法，所述漂洗液包含20mol/LNaCl，2mol/LTris-HCl和乙醇，所述乙醇在所述漂洗液中的体积百分数为70％，所述漂洗液的pH为8.0。具体的，上述粪污噬菌体DNA的提取方法，所述步骤S1中反应条件为37℃温育1h。具体的，上述粪污噬菌体DNA的提取方法，所述S2中加入的蛋白酶K至蛋白酶K的终浓度为50μg/mL，所述S2中加入蛋白酶K后反应的条件为55℃温育1h，所述步骤S2中添加蛋白酶K时，还添加SDS至SDS的质量终浓度为0.5％。具体的，上述粪污噬菌体DNA的提取方法，所述粪污预处理包括以下步骤：向粪便中加入SM缓冲液，震荡，过滤，得到粪污预处理液，将粪污预处理液离心取上清，过滤，得到滤液。一种利用前述粪污噬菌体DNA的提取方法提取粪污噬菌体DNA的试剂盒，包括硅胶吸附柱，还包括以下试剂：(1)蛋白酶K；(2)结合液，所述结合液包含8mol/L盐酸胍，20mmol/LTris-HCl，所述结合液的pH为6.5；(3)去蛋白液：所述去蛋白液包含4mol/L盐酸胍，20mmol/LTris-HCl和乙醇，所述乙醇在所述去蛋白液中的体积百分数为70％，所述蛋白液的pH为6.5；(4)漂洗液：所述漂洗液包含20mol/LNaCl，2mol/LTris-HCl和乙醇，所述乙醇在所述漂洗液中的体积百分数为70％，所述漂洗液的pH为8.0；(5)TE洗脱液。一种前述试剂盒在提取粪污噬菌体DNA中的应用。本专利技术的有益效果为：通过对现有技术的改进，结合100-kDa超滤浓缩器和硅胶吸附柱可以在5h内获得浓度约为53.47ng/μL的粪污噬菌体DNA，本专利技术提供的粪污噬菌体DNA的提取方法不仅缩短了提取时间，且提取的DNA浓度和纯度较好，满足后期qPCR和宏基因组测序要求。附图说明图1是本专利技术的粪污噬菌体DNA提取过程中浓缩液示意图；图2是本专利技术实施例2中16SrDNA的PCR检测结果图；图3是本专利技术实施例2中噬菌体基因组DNA凝胶电泳图。具体实施方式下面结合附图及具体实施例对本专利技术做进一步阐释。实施例1：本实施例的目的在于提供一种粪污噬菌体DNA的提取方法，包括如下步骤：(1)称取鸡粪3g，所述鸡粪来源于25日龄罗曼粉蛋鸡的新鲜鸡粪，采集自饲养规模为5万只蛋鸡的养殖场，封闭式鸡舍；放于无菌50mL管中，加入40mLSM缓冲液，置于旋涡振荡器上充分震荡30min，使附着于粪便上的噬菌体充分释放到缓冲液中；然后用孔径100μm的筛网过滤，去除较大的颗粒杂质；滤液2,500g离心5min，接着10,000g离心10min，然后采用0.45和0.22μm滤器去除细菌和真核细胞，获得滤液。(2)参考Quirós和Colomer-Lluch等采用的提取方法，利用100-kDa超滤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种粪污噬菌体DNA的提取方法，其特征在于，该方法采用超滤浓缩法和硅胶吸附柱法相结合，即首先采用超滤浓缩器浓缩纯化噬菌体，然后再采用硅胶吸附柱法提取噬菌体DNA。

【技术特征摘要】
1.一种粪污噬菌体DNA的提取方法，其特征在于，该方法采用超滤浓缩法和硅胶吸附柱法相结合，即首先采用超滤浓缩器浓缩纯化噬菌体，然后再采用硅胶吸附柱法提取噬菌体DNA。2.根据权利要求1所述的粪污噬菌体DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)超滤浓缩法浓缩纯化噬菌体：对粪污进行预处理，得到滤液，利用100-kDa超滤浓缩器对滤液进行浓缩，得到浓缩液；(2)硅胶吸附柱法提取噬菌体DNA，具体包含以下步骤：S1:向所述浓缩液中加入DNaseI，反应后加入EDTA灭活DNaseI，得到中间液一；S2:向所述中间液一中加入蛋白酶K裂解噬菌体，反应，离心，取上清，得到噬菌体裂解液上清；S3:向所述噬菌体裂解液上清中加入DNA结合液，混匀，加入乙醇，混匀，得到中间液二，将中间液二移入吸附柱，离心，去滤液，得到吸附柱一；S4:向吸附柱一中加入去蛋白液，离心，去滤液，得到吸附柱二：S5:向吸附柱二中加入漂洗液，离心，去滤液，得吸附柱；S6:重复步骤S5；S7:向吸附柱中加入TE洗脱液，离心，得到滤液，即所述粪污噬菌体DNA。3.根据权利要求1或2所述的粪污噬菌体DNA的提取方法，其特征在于：所述结合液包含8mol/L盐酸胍，20mmol/LTris-HCl，所述结合液的pH为6.5。4.根据权利要求3所述的粪污噬菌体DNA的提取方法，其特征在于：所述去蛋白液包含4mol/L盐酸胍，20mmol/LTris-HCl和乙醇，所述乙醇在所述去蛋白液中的体积百分数为70％，所述蛋白液的pH为6.5。5.根据权利要求4所述的粪污噬菌体DNA的提取方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张安云，杨艳鲜，王红宁，雷昌伟，杨鑫，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51