小鼠精液基因组DNA提取方法技术

本发明专利技术涉及一种从小鼠精液中提取高质量基因组DNA的方法，所述方法利用了特定的样品预处理、样品消化步骤后再进行DNA提取。提取的基因组DNA浓度、纯度高，完整性好，充分满足PCR扩增的要求。

Genomic DNA extraction from mouse semen

The present invention relates to a method for extracting high quality genomic DNA from mouse semen. The method utilizes specific sample pretreatment, sample digestion steps and then DNA extraction. The extracted genomic DNA has high purity and integrity, and fully meets the requirements of PCR amplification.

【技术实现步骤摘要】
小鼠精液基因组DNA提取方法
本专利技术涉及一种DNA的提取方法，特别是一种精液中DNA的提取操作方法。
技术介绍
众所周知，基因组DNA是动物遗传物质的载体，分子生物学的发展离不开基因组DNA的提取与保存。目前从动物的血液、肌肉或肝脏等组织中提取DNA已是成熟且普遍的技术，但是在小鼠模型制备过程中通常会保存雄性的精液来保障项目后期需求，其遗传物质即精子存在于精液中。而精子是与组织极为不同的样品，与其他细胞不同，精子的染色质形成经过了加倍浓缩与组装。成熟精子核的致密化现象造成精子相对于其它组织细胞的染色体更加致密，基因组DNA不容易与精蛋白脱离，使得精子DNA在消化中释放困难，产率低。组织基因组抽提方法不能分离精液基因组DNA。在实际应用中，冻存的精液量更少，常用的麦管法冷冻保存的精液只有10μl/管，通过常规提取方式难以获得足够后期检测用的DNA。现有技术中尚缺乏针对小鼠精液，特别是冷冻精液DNA提取的有效方法，本专利技术旨在摸索建立一种可靠的从小鼠冷冻精液中提取高质量DNA的方法，能够填补基因组DNA提取技术中关于小鼠精液，特别是冷冻精液中基因组DNA提取的技术空白，继而推广应用通过本方法可以将冻存或新鲜的小鼠精液DNA提取出来做相关检测。
技术实现思路
本专利技术提供了一种可靠的从小鼠冷冻精液中提取高质量DNA的方法。所述方法依次包括样品预处理、样品消化和DNA提取步骤，其特征在于，样品预处理步骤为：(1)取10μl精液于离心管中，加入75％乙醇涡旋混匀，离心，小心倾倒弃去上清；(2)复步骤(1)一次；(3)室温离心，用移液枪吸出残留的乙醇；(4)室温晾干；样品消化步骤为：(1)向上述离心管中加入200μl-500μlTail-Buffer重悬沉淀，加入Triton-X100、DTT和ProteinaseK，混合均匀后置于50℃金属浴震荡器、水浴或55℃烘箱内孵育过夜；所述Tail-buffer的组分为：终浓度为50mM的Tris-HCl(PH8.0)、100mM的EDTA(PH8.0)、100mM的NaCl和1％SDS溶液。(2)室温离心，小心吸取上清至新的离心管内，此处一定要注意避免吸取絮状沉淀物；然后进行DNA提取。优选的，所述Tail-buffer的配方如下表所示：优选的，其中DNA提取步骤为乙醇沉淀法：加入950μl的-20℃预冷的无水乙醇并上下颠倒离心管8次以充分混匀，室温14,000g离心20min，小心倾倒弃去上清；加入500μl75％乙醇并上下颠倒离心管8次洗涤一遍，室温14,000g离心10min，小心倾倒弃去上清；14,000g离心1min，用移液枪吸去残留的75％乙醇，室温晾干20min，肉眼观察无液体残留，确保没有乙醇残留，加入30μlddH20室温充分溶解20min，手指轻弹10次/5min，电泳检测浓度后保存或用于后续试验；或酚:氯仿抽提法：加入等体积酚:氯仿，涡旋震荡以充分混匀，14,000g室温离心20min，用剪去尖端并过火的1ml吸头小心吸取300μl上层液体，至新的1.5ml离心管；加入600μl的-20℃预冷的无水乙醇并上下颠倒离心管8次以充分混匀，室温14,000g离心10min，小心倾倒弃去上清；加入500μl75％乙醇洗涤一遍，室温14,000g离心10min，小心倾倒弃去上清；14,000g离心1min，用移液枪吸去残留的75％乙醇，室温晾干20min；加入30μlddH20室温充分溶解20min，手指轻弹10次/5min，紫外分光光度计及电泳检测浓度后保存或用于后续试验。优选的，样品预处理步骤中的离心条件为室温14,000g离心5min，晾干时间为10min。优选的，样品消化步骤中Tail-Buffer的用量为400μl，加入的Triton-X100为2.5μl0.5％的Triton-X100。优选的，样品消化步骤中Tail-Buffer的用量为400μl，加入的DTT为20μl1M的DTT。优选的，样品消化步骤中Tail-Buffer的用量为400μl，加入的ProteinaseK为20μl10mg/ml的ProteinaseK。优选的，样品消化的步骤(2)中室温14,000g离心10min，小心吸取≤380μl上清至新的1.5ml离心管内。本专利技术还提供一种小鼠精液基因组DNA提取试剂盒，其包括：试剂I：75％乙醇试剂II：Tail-Buffer，其配方为试剂III：0.5％的Triton-X100：将Triton-X100倍比稀释至0.5％；试剂IV：1MDTT，配方：称取1.54gDTT溶于10mlddH20中；试剂V：10mg/mlProteinaseK。进一步地，还提供所述的试剂盒在提取小鼠精液基因组DNA中的应用。本专利技术针对小鼠精液建立的基因组DNA提取方法具有以下积极效果：1.采用本专利技术的操作方法可以提取出小鼠冷冻精液中的DNA，提取的基因组DNA浓度和纯度高，并能用于PCR模板进行检测。2.本专利技术提取步骤简单易行，通过简单的预处理以及样品消化步骤大大提高了小鼠精液DNA的提取效果，提取的基因组DNA浓度、纯度高，完整性好，充分满足PCR扩增的要求。附图说明图1为本专利技术实施例1精液基因组DNA的提取试剂和方法提取冷冻小鼠精液基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1-10、2-10、3-10、4-10、5-10、6-10、7-10分别代表以10μl精液为起始材料采用实施例1中实验组1-7的方式提取出的基因组DNA。T14是λ-T14digestmarker，条带大小分别为：19329bp/7743bp/6223bp/4254bp/3472bp/2690bp/1882bp/1489bp/925bp/421bp/74bp。DL2000marker条带大小分别为：2000bp/1000bp/750bp/500bp/250bp/100bp。图2为本专利技术实施例1以提取出的冷冻精液基因组为PCR模板的扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。其中，1-10、2-10、3-10、4-10、5-10、6-10、7-10分别代表以10μl精液为起始材料采用实施例1中实验组1-7的方式提取出的基因组DNA为模板；“+”为以B6J鼠尾样品提供的基因组DNA为模板进行扩增；N为空白对照；DL2000marker：2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。实施例1：提取小鼠冷冻精液DNA及分析一、试剂1MDTT配方：称取1.54gDTT(二硫苏糖醇)溶于10mlddH20中。0.5％的Triton-X100：将Triton-X100倍比稀释至0.5％作为储液。TailBuffer配方(500ml)ProteinaseK(货号V900887-100MG，品牌Vetec)。二、实验分组：实验组1：样品预处理+样品消化(Tail-Buffer+Triton-X100+DTT+ProteinaseK)+DNA提取实验组2：样品消化(Tail-Buffer+Triton-X100+DTT+ProteinaseK)+DNA提取实验组3：样品预处理+样品消化(T本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小鼠精液基因组DNA的提取方法，依次包括样品预处理、样品消化和DNA提取步骤，其特征在于，样品预处理步骤为：(1)取10μl精液于离心管中，加入75％乙醇涡旋混匀，离心，小心倾倒弃去上清；(2)复步骤(1)一次；(3)室温离心，用移液枪吸出残留的乙醇；(4)室温晾干；样品消化步骤为：(1)向上述离心管中加入200μl‑500μl Tail‑Buffer重悬沉淀，加入Triton‑X100、DTT和Proteinase K，混合均匀后置于50℃金属浴震荡器、水浴或55℃烘箱内孵育过夜；所述Tail‑buffer的组分为：终浓度为50mM的Tris‑HCl(PH8.0)、100mM的EDTA(PH8.0)、100mM的NaCl和1％SDS溶液。(2)室温离心，小心吸取上清至新的离心管内，此处一定要注意避免吸取絮状沉淀物；然后进行DNA提取。

【技术特征摘要】
1.一种小鼠精液基因组DNA的提取方法，依次包括样品预处理、样品消化和DNA提取步骤，其特征在于，样品预处理步骤为：(1)取10μl精液于离心管中，加入75％乙醇涡旋混匀，离心，小心倾倒弃去上清；(2)复步骤(1)一次；(3)室温离心，用移液枪吸出残留的乙醇；(4)室温晾干；样品消化步骤为：(1)向上述离心管中加入200μl-500μlTail-Buffer重悬沉淀，加入Triton-X100、DTT和ProteinaseK，混合均匀后置于50℃金属浴震荡器、水浴或55℃烘箱内孵育过夜；所述Tail-buffer的组分为：终浓度为50mM的Tris-HCl(PH8.0)、100mM的EDTA(PH8.0)、100mM的NaCl和1％SDS溶液。(2)室温离心，小心吸取上清至新的离心管内，此处一定要注意避免吸取絮状沉淀物；然后进行DNA提取。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Tail-buffer的配方如下表所示：3.根据权利要求1或2所述的方法，其中DNA提取步骤为乙醇沉淀法：加入950μl的-20℃预冷的无水乙醇并上下颠倒离心管8次以充分混匀，室温14,000g离心20min，小心倾倒弃去上清；加入500μl75％乙醇并上下颠倒离心管8次洗涤一遍，室温14,000g离心10min，小心倾倒弃去上清；14,000g离心1min，用移液枪吸去残留的75％乙醇，室温晾干20min，肉眼观察无液体残留，确保没有乙醇残留，加入30μlddH20室温充分溶解20min，手指轻弹10次/5min，电泳检测浓度后保存或用于后续试验；或酚:氯仿抽提法：加入等体积酚:氯仿，涡旋震荡以充分混匀，14,000g室温离心20min，用剪去尖端并过火的1ml吸头小心吸取300μl上层液体，至新的1.5ml离心管；加入600μl的-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵静，琚存祥，张明坤，陶裴裴，侯欢欢，高翔，
申请(专利权)人：江苏集萃药康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32