等位基因选择性基因编辑及其用途制造技术

本发明专利技术涵盖用于引导CRISPR基因编辑的治疗导向分子的化合物、结构、组合物和方法。用于引导基因编辑的导向分子可以是等位基因选择性的或疾病等位基因选择性的，并且可以表现出降低的脱靶活性。导向分子可以包括单体，所述单体包括UNA单体、核酸单体和修饰的核苷酸，其中所述化合物靶向于基因组DNA。本发明专利技术的导向分子可以用作体外、离体或体内编辑或破坏基因的活性成分。

Allele selective gene editing and its use

The invention covers compounds, structures, compositions and methods for guiding therapeutic molecules of CRISPR gene editing. The guiding molecules used to guide gene editing can be selective of alleles or disease alleles and can show reduced Miss activity. The directing molecule may include a monomer comprising a UNA monomer, a nucleic acid monomer, and a modified nucleotide, wherein the compound is targeted to genomic DNA. The guiding molecule of the invention can be used as an active ingredient for editing or destroying genes in vitro, in vitro or in vivo.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】等位基因选择性基因编辑及其用途
本专利技术涉及用于编辑基因和调节基因表达的生物药物和治疗剂领域。更具体地说，本专利技术涉及用于编辑或改变多核苷酸(包括基因组多核苷酸)并最终用于体内基因编辑和调节、破坏、激活或抑制基因表达的方法和组合物。序列表本申请包括作为名为ARC5237WO_SL.txt的ASCII文件以电子方式提交的序列表。
技术介绍
对预定位点特异性的基因编辑可以用靶标导向型核酸酶Cas9和多核苷酸修复方法完成。使用靶标导向型Cas9内切核酸酶，可以在靶位点附近切割双链DNA的两条链以产生双链断裂。Cas9的靶标特异性由导向分子决定，所述导向分子使Cas9与多核苷酸靶标复合。典型地为17-20个碱基长度的多核苷酸靶序列必须侧接3′原型间隔区相邻基序(protospacer-adjacentmotif；PAM)。PAM的结构由衍生Cas9的细菌物种决定。偶然地，在大多数物种中的大多数感兴趣的基因中可以找到含有PAM的合适靶序列。在一个变体中，导向分子可以制成单RNA链，其具有与靶标互补的序列，该导向分子连接于与Cas9复合的、由细菌衍生的crispr-tracrRNA序列。在某些模式中，在dsDNA的特定位点形成双链断裂后，可以修复断裂以实现DNA的编辑。双链断裂可以通过非同源末端接合(NHEJ)来修复，以产生随机插入和缺失。双链断裂还可以使用外源DNA模板通过同源介导的修复(HDR)来修复，以产生受控的插入、缺失和取代。用Cas9进行基因编辑的主要缺点是导向分子对靶多核苷酸的效力可能有限。导向分子的特异性和活性可能是不可预测的。用于Cas9编辑的导向分子可以在效力方面变化很大，并且一些原本遵循结构方案的导向物可能是无效的。用Cas9进行基因编辑的另一个缺点是导向分子可能缺乏对靶等位基因的选择性。基因组变异可能促进疾病状况。一些与疾病表型相关的等位基因已经在医学遗传学中被确认。无法靶向特定等位基因是当前基因编辑方法的显著缺点。用CRISPR-Cas系统进行基因编辑的其他缺点包括脱靶突变的发生。需要用于基因编辑的稳定且有效的导向分子，以及用于治疗疾病的组合物和方法。迫切需要用于通过Cas9引导基因编辑的新分子，以及具有等位基因选择性和降低的脱靶活性的新分子。
技术实现思路
本专利技术提供了对CRISPR基因编辑可以是高度有效的导向分子。本专利技术的组合物和方法可用于体内、离体和体外的基因编辑。本专利技术进一步考虑用通过新颖的等位基因选择性导向分子引导的Cas酶进行基因编辑的方法。在一些实施方案中，本专利技术的导向分子可用于与CRISPR-Cas系统一起进行基因编辑，其中脱靶突变的发生有所减少。使用Cas9，本专利技术的导向分子可以提供有效的基因编辑。本专利技术的导向分子对于基因编辑可以是有效的，以基于一种或多种核苷酸多态性在等位基因变异之间进行选择。本公开的导向分子的另外的优点包括减少的脱靶效应。在一些实施方案中，对于靶向基因组DNA并通过CRISPR/Cas基因编辑产生双链断裂，本专利技术的导向分子可表现出非凡的、令人惊讶的等位基因选择性水平。在某些实施方案中，本专利技术的导向分子可以提供降低的脱靶活性和更高的基因编辑效率。本专利技术还考虑用通过导向分子引导的Cas进行基因编辑的方法以及通过包括NHEJ和HDR修复机制的任何机制进行基因修复的方法。本专利技术的导向分子可以有利地提高由Cas引导的基因工程的效率。在一些实施方案中，本专利技术的导向分子可以有利地提高由Cas9引导的基因工程的效率并且通过NHEJ提供高频率的靶向诱变。在另外的实施方案中，本专利技术的导向分子可以有利地提高由Cas9引导的基因工程的效率，并且使用HDR提供对任何基因组靶标的精确DNA整合。在一些方面，本专利技术的导向分子可以增强体内Cas9结合和DNA裂解。本专利技术还提供了欲用作各种疾病和病况的治疗剂的新颖分子。本专利技术的分子可以在用于改善、预防或治疗各种疾病和病况的组合物中用作活性药物成分。在一些方面，本专利技术提供了具有这样的结构的导向分子，所述结构可以包括连接基团(linkergroup)、成链单体、非天然核苷酸、修饰的核苷酸或化学修饰的核苷酸以及某些天然核苷酸的各种组合。对于靶向基因组DNA，这些导向分子可以表现出等位基因选择性。本公开提供了可用于执行CRISPR-Cas基因编辑的、脱靶突变有所减少的导向分子。本专利技术的实施方案包括以下内容：一种靶向于基因组DNA的导向化合物，其包含连接到crRNA的14-24个连续单体的靶标导向链，其中所述导向化合物引导对所述基因组DNA的CRISPR基因编辑。上述导向化合物，其中所述单体包括UNA单体和核酸单体，并且其中所述导向化合物包含靶向的碱基序列，以引导对所述基因组DNA的CRISPR基因编辑。上述导向化合物，其中所述靶标导向链的碱基序列与所述基因组DNA具有至多三个错配。上述导向化合物，其中所述导向化合物含有1至5个UNA单体。上述导向化合物，其中所述核酸单体选自天然核苷酸、非天然核苷酸、修饰的核苷酸、化学修饰的核苷酸及其组合。上述导向化合物，其中所述核酸单体中的一种或多种是2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-O-甲基嘌呤核苷酸、2＇-脱氧-2＇-氟代核糖核苷酸、2＇-脱氧-2＇-氟代嘧啶核苷酸、2＇-脱氧核糖核苷酸、2＇-脱氧嘌呤核苷酸、通用碱基核苷酸、5-C-甲基-核苷酸、反向脱氧无碱基单体残基、3＇末端稳定化核苷酸、3＇-甘油基核苷酸、3′-反向无碱基核苷酸、3＇-反向胸苷、锁核酸核苷酸(LNA)、2′-O，4′-C-亚甲基-(D-呋喃核糖基(D-ribofuranosyl))核苷酸、2＇-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸、2＇-甲基-硫乙基、2＇-脱氧-2＇-氟代核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、2＇，4＇-限制性2′-O-甲氧基乙基(cMOE)、2′-O-乙基(cEt)、2′-氨基核苷酸、2′-O-氨基核苷酸、2′-C-烯丙基核苷酸、2′-O-烯丙基核苷酸、N6-甲基腺苷核苷酸、具有经修饰的碱基5-(3-氨基)丙基尿苷的核苷酸、具有经修饰的碱基5-(2-巯基)乙基尿苷的核苷酸、具有经修饰的碱基5-溴尿苷的核苷酸、具有经修饰的碱基8-溴鸟苷的核苷酸、具有经修饰的碱基7-脱氮腺苷的核苷酸、经2’-O-氨基丙基取代的核苷酸，或2′-OH基团被2′-R、2′-OR、2＇-卤素、2′-SR或2′-氨基取代的核苷酸，其中R可以是H、烷基、烯基或炔基。上述导向化合物，其中所述导向化合物的每个末端的最后三个单体中的一个或多个通过硫代磷酸酯键、手性硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键连接。上述导向化合物，其中所述导向化合物引导选自TTR、BIRC5、CDK16、STAT3、CFTR、F9、KRAS和CAR的基因中的双链断裂。上述导向化合物，其中所述基因组DNA含有目标疾病相关的单核苷酸多态性。上述导向化合物，其中所述导向化合物引导疾病相关等位基因中的双链断裂。上述导向化合物，其中所述导向化合物引导选自V30MTTR、G284RColA1、L132P角蛋白12、R135T角蛋白12、G85RSOD1、G272VTau、P301LTau、V337MTau、R406WTau、Q39STOPβ-球蛋白、T8993G/CmtDNA、G719SEGFR和G12CKr本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向于基因组DNA的导向化合物，其包含连接到crRNA的14‑24个连续单体的靶标导向链，其中所述导向化合物引导对所述基因组DNA的CRISPR基因编辑。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.21 US 62/221,407;2016.05.02 US 62/330,8271.一种靶向于基因组DNA的导向化合物，其包含连接到crRNA的14-24个连续单体的靶标导向链，其中所述导向化合物引导对所述基因组DNA的CRISPR基因编辑。2.如权利要求1所述的导向化合物，其中所述导向化合物引导人类基因TTR中的双链断裂，并且靶标导向链包含5’-UGCAUGGCCACAUUGAUGGC-3’(SEQIDNO：13)的16-20个连续单体，其中所述crRNA连接在所述靶标导向链的3＇末端，以及所述导向化合物的取代或修饰形式。3.如权利要求2所述的导向化合物，其中所述导向化合物包含SEQIDNO：32。4.如权利要求1所述的导向化合物，其中所述导向化合物引导人类基因TTR中的双链断裂，并且靶标导向链包含5’-CACAUGCAUGGCCACAUUGA-3’(SEQIDNO：40)的16-20个连续单体，其中所述crRNA连接在所述靶标导向链的3′末端，以及所述导向化合物的取代或修饰形式。5.如权利要求4所述的导向化合物，其中所述导向化合物包含SEQIDNO：61。6.如权利要求1所述的导向化合物，其中所述crRNA是5’-GUUUUAGAGCUAUGCU-3’(SEQIDNO：605)和其取代或修饰形式。7.如权利要求1所述的导向化合物，其中所述单体包括UNA单体和核酸单体，并且其中所述导向化合物包含靶向的碱基序列，以引导对所述基因组DNA的CRISPR基因编辑。8.如权利要求2所述的导向化合物，其包含一个或多个UNA单体。9.如权利要求4所述的导向化合物，其包含一个或多个UNA单体。10.如权利要求7所述的导向化合物，其中靶标导向链的碱基序列与所述基因组DNA具有至多三个错配。11.如权利要求7所述的导向化合物，其中所述导向化合物含有1至5个UNA单体。12.如权利要求7所述的导向化合物，其中所述核酸单体选自天然核苷酸、非天然核苷酸、修饰的核苷酸、化学修饰的核苷酸及其组合。13.如权利要求7所述的导向化合物，其中所述核酸单体中的一种或多种是2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-O-甲基嘌呤核苷酸、2＇-脱氧-2＇-氟代核糖核苷酸、2′-脱氧-2＇-氟代嘧啶核苷酸、2＇-脱氧核糖核苷酸、2＇-脱氧嘌呤核苷酸、通用碱基核苷酸、5-C-甲基-核苷酸、反向脱氧无碱基单体残基、3＇末端稳定化核苷酸、3′-甘油基核苷酸、3＇-反向无碱基核苷酸、3＇-反向胸苷、锁核酸核苷酸(LNA)、2′-O，4′-C-亚甲基-(D-呋喃核糖基)核苷酸、2＇-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸、2′-甲基-硫乙基、2＇-脱氧-2＇-氟代核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、2′，4′-限制性2′-O-甲氧基乙基(cMOE)、2′-O-乙基(cEt)、2′-氨基核苷酸、2′-O-氨基核苷酸、2′-C-烯丙基核苷酸、2′-O-烯丙基核苷酸、N6-甲基腺苷核苷酸、具有经修饰的碱基5-(3-氨基)丙基尿苷的核苷酸、具有经修饰的碱基5-(2-巯基)乙基尿苷的核苷酸、具有经修饰的碱基5-溴尿苷的核苷酸、具有经修饰的碱基8-溴鸟苷的核苷酸、具有经修饰的碱基7-脱氮腺苷的核苷酸、经2’-O-氨基丙基取代的核苷酸，或2′-OH基团被2′-R、2′-OR、2′-卤素、2′-SR或2′-氨基取代的核苷酸，其中R可以是H、烷基、烯基或炔基。14.如权利要求7所述的导向化合物，其中所述导向化合物的每个末端处的最后三个单体中的一个或多个通过硫代磷酸酯键、手性硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键连接。15.如权利要求1所述的导向化合物，其中所述导向化合物引导选自TTR、BIRC5、CDK16、STAT3、CFTR、F9、KRAS和CAR的基因中的双链断裂。16.如权利要求1所述的导向化合物，其中所述基因组DNA含有目标疾病相关的单核苷酸多态性。17.如权利要求1所述的导向化合物，其中所述导向化合...

【专利技术属性】
技术研发人员：帕德马纳巴·契吾库拉，R·威尔基格兰瑟姆，立川洁，
申请(专利权)人：阿克丘勒斯治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国,US