大RNA的脂质纳米颗粒包封制造技术

一种生产脂质包封的RNA纳米颗粒的方法，其包括使包含RNA的水溶液流过具有第一内径(ID)的第一管；所述RNA包含约6,000至约13,000个核苷酸；使包含脂质的乙醇溶液以相对于通过第一管的水溶液的约0.2至约1倍的流速流过具有第二内径(ID)的第二管，所述脂质包含阳离子脂质；和将所述乙醇溶液与所述水溶液混合；第一ID和第二ID以及通过第一管和第二管的流速被选择为产生低到足以保持RNA完整性的剪切力；该混合产生在第一管中流动的输出溶液，该输出溶液包含在约乙醇中的RNA和脂质的湍流，该脂质包封的RNA纳米颗粒具有双层结构。该脂质包封的RNA纳米颗粒具有双层结构。该脂质包封的RNA纳米颗粒具有双层结构。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】大RNA的脂质纳米颗粒包封
[0001]相关申请
[0002]根据35U.S.C.119(e)，本申请享有2020年9月13日提交的美国临时专利申请号63/077,648的优先权，该美国临时专利申请以其整体并入本文。
[0003]专利技术背景
[0004]脂质用作用于核糖核酸(RNA)递送的材料，因为它们能够形成脂质纳米颗粒，该脂质纳米颗粒包封RNA以在肠胃外施用后递送到靶细胞(Zimmermann,2006,Nature,doi:10.1038/nature04688)。
[0005]生产脂质包封的RNA纳米颗粒的不同方法是已知的。例如，WO 2001/005373公开了使用乙醇注射型工艺利用静态混合器制备脂质包封的RNA纳米颗粒的技术，该静态混合器提供在囊泡形成后与治疗分子组合的湍流环境。US 2004/0142025公开了使用非湍流混合和一系列依序逐步稀释形成脂质包封的RNA纳米颗粒的技术。US 6,843,942公开了一种形成颗粒的非湍流混合方法，该方法通过将有机溶液管道中的脂质通过孔口喷射到流过该孔口的水溶液中的核酸中来实现。US 9,005,654公开了使用湍流混合将siRNA包封在脂质纳米颗粒(LNP)中，由此脂质和RNA作为相反的流动以大约相等的速率从相对的臂进入T形混合室，以产生包含囊泡的45
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60％乙醇溶液，该囊泡被收集并且被进一步稀释(直接稀释法)。US 9,404,127公开了通过直接稀释法生产的大多数LNP具有非层状形态，即非双层结构。
[0006]在尝试应用传统方法从大RNA形成脂质包封的RNA纳米颗粒时出现了挑战。例如，一个这样的问题是由LNP形成期间施加在RNA上的力导致RNA的结构完整性受损而引起的。因此，需要改进用于在大RNA序列的情形下配制脂质包封的RNA纳米颗粒的工艺和装置。此类方法在以期望的粒度和多分散性为目标的同时还应易于放大。本文的实施方案解决了这些问题中的一个或多个以及本领域技术人员认识到的其他挑战。

技术实现思路

[0007]在一些方面，本文的实施方案提供了生产脂质包封的RNA纳米颗粒的方法，该方法包括以下步骤：a)使包含RNA的水溶液流过内径(ID)为约0.01英寸至约0.08英寸的第一管；其中该水溶液的pH在约3.0至约4.5的范围内，任选的NaCl浓度高达约300mM；其中该RNA包含约6,000至约13,000个核苷酸；b)使包含脂质的乙醇溶液以通过该第一管的水溶液流速的约0.2至约1倍的流速流过内径为约0.01英寸至约0.04英寸的第二管，其中该脂质包含阳离子脂质；以及c)将该乙醇溶液与该水溶液混合；其中该混合产生在第一管中流动的输出溶液，该输出溶液包含在约10％至75％乙醇v/v中的RNA和脂质的湍流；并且其中该脂质包封的RNA纳米颗粒具有双层结构。
[0008]在一些方面，本文的实施方案提供了生产脂质包封的RNA纳米颗粒的方法，该方法包括以下步骤：a)使包含RNA的水溶液流过具有第一内径(ID)的第一管；其中该RNA包含约6,000至约13,000个核苷酸；b)使包含脂质的乙醇溶液以通过第一管的水溶液的流速的约0.2至约1倍的流速流过具有第二内径(ID)的第二管，其中该脂质包含阳离子脂质；以及c)
将该乙醇溶液与该水溶液混合；其中第一ID和第二ID以及通过第一管和第二管的流速被选择为产生低到足以保持RNA的完整性的剪切力；其中该混合产生在第一管中流动的输出溶液，该输出溶液包含在约10％至75％之间的乙醇v/v中的RNA和脂质的湍流；并且其中该脂质包封的RNA纳米颗粒具有双层结构。
[0009]附图描述
[0010]图1示出了生产脂质纳米颗粒的工艺的一个实施方案的流程图。将脂质溶解在乙醇中，将RNA溶解在水性酸性缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液)中，两者都经过过滤灭菌。通过本文所述的工艺混合该溶液以形成颗粒，分析该颗粒的PDI和粒度(PS)。通过切向流过滤(TFF)浓缩和纯化该颗粒以去除乙醇和未结合的RNA，并且再次监测PDI和PS。然后根据测得的总RNA浓度调整该颗粒的浓度。对该颗粒进行过滤杀菌、灌装、最后加工和冷冻。
[0011]图2示出了用于生产脂质包封的RNA纳米颗粒的装置。包含RNA的水溶液由HPLC泵通过管道运送，并且包含脂质的有机溶液由HPLC泵通过单独的管道运送。有机溶液可以在混合区中以90度角被泵送到水溶液中。出口管道将混合的脂质
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RNA出口运送到聚丙烯管道，该聚丙烯管道以45度角与稀释区中的稀释缓冲液汇合。该以45度角与稀释区中的稀释缓冲液汇合的管道可以被串联稀释以包括1、2、3或4个管道稀释区，每个管道稀释区均以45度角用于稀释过程。稀释过程之后，可以将经稀释颗粒收集在维持在15
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20℃的不锈钢夹套容器中。使用蠕动泵、隔膜泵或离心泵通过切向流过滤进一步处理该颗粒。
[0012]图3更详细地示出了混合模块。缓冲液中的核酸通过第一不锈钢管的输入臂运送。乙醇(或其他合适的有机溶剂/溶剂混合物)中的脂质通过垂直附接到第一管的第二不锈钢管运送。第一管的壁中的孔洞允许液体从第二管被运送到第一管的内部。由混合产生的脂质包封的RNA纳米颗粒通过第一管的输出臂排出。
[0013]图4示出了针对实施例13中描述的不同剂量水平的脂质纳米颗粒配制物的调整的平均荧光强度(MFI)，该平均荧光强度对应于响应于向小鼠施用脂质纳米颗粒而产生的抗
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COVID19刺突蛋白抗体水平。
具体实施方式
[0014]应了解，本领域的技术人员将从本公开容易明白主题技术的其他构造，在本公开中通过图示示出且描述了主题技术的各种构造。如将认识到的，主题技术能够具有其他和不同的构造，并且主题技术的若干细节能够在各种其他方面进行修改，所有这些都不脱离主题技术的范围。因此，
技术实现思路
、附图和具体实施方式本质上应视为说明性的而不是限制性的。
[0015]本文的实施方案提供了用于将大RNA(例如，自复制RNA)包封在脂质纳米颗粒中的工艺。例如，大的mRNA的尺寸可能在6,000到大约15,000个核苷酸之间。如本文所公开，发现这些大核苷酸与典型的LNP形成工艺不相容。通常用于制作mRNA
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LNP组合物的LNP工艺被用来尝试制作包封有自复制型RNA的LNP。以下程序对于含有约1,000至约5,000个核苷酸的RNA是典型的。大体积的配制物(Bulk formulation)是通过如下所概述将脂质的乙醇溶液与RNA药物物质或其他较小mRNA的水溶液混合来制造：
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将脂质赋形剂(阳离子脂质、磷脂、胆固醇(Chol)和PEG
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脂质缀合物溶解在乙醇中，并通过0.2μm聚醚砜(PES)过滤器过滤。
[0017]·
在柠檬酸盐pH 4.0缓冲液中制备mRNA水溶液，随后通过0.2μm PES过滤器过滤。
[0018]·
然后经由不锈钢混合模块将mRNA溶液与脂质乙醇溶液混合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生产脂质包封的RNA纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：a)使包含RNA的水溶液流过具有约0.01英寸至约0.08英寸的内径(ID)的第一管；其中所述水溶液的pH在约3.0至约4.5的范围内，任选的NaCl浓度高达约300mM；其中所述RNA包含约6,000至约13,000个核苷酸；b)使包含脂质的乙醇溶液以通过所述第一管的水溶液的流速的约0.2至约1倍的流速流过具有约0.01英寸至约0.04英寸的ID的第二管，其中所述脂质包括阳离子脂质；和c)将所述乙醇溶液与所述水溶液混合；其中所述混合产生在所述第一管中流动的输出溶液，所述输出溶液包含在约10％至75％乙醇v/v中的RNA和脂质的湍流；和其中所述脂质包封的RNA纳米颗粒具有双层结构。2.一种生产脂质包封的RNA纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：a)使包含RNA的水溶液流过具有第一内径(ID)的第一管；其中所述RNA包含约6,000至约13,000个核苷酸；b)使包含脂质的乙醇溶液以通过第一管的水溶液的流速的约0.2至约1倍的流速流过具有第二内径(ID)的第二管，其中所述脂质包括阳离子脂质；和c)将所述乙醇溶液与所述水溶液混合；其中所述第一ID和第二ID以及通过所述第一管和第二管的流速被选择为产生低到足以产生保持所述RNA的完整性的剪切力；其中所述混合产生在所述第一管中流动的输出溶液，所述输出溶液包含在约10％至75％之间的乙醇v/v中的RNA和脂质的湍流；和其中所述脂质包封的RNA纳米颗粒具有双层结构。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述混合包括使所述乙醇溶液和所述水溶液流入由垂直联接到所述第一管的第二管组成的混合模块中。4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述混合包括使所述乙醇溶液和所述水溶液流入多入口涡流混合器中。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述水溶液中的RNA浓度在约85微克/mL至约2100微克/mL的范围内。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述乙醇溶液中脂质的浓度在约5.0mg/mL至约125mg/mL的范围内。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述水溶液由具有不超过约200psi的背压的第一泵通过所述第一管泵送，并且所述乙醇溶液由第二泵通过所述第二管泵送。8.如权利要求1所述的方法，其中所述第一管具有在约0.02英寸至约0.03英寸的范围内的ID，并且所述第二管具有在约0.01英寸至约0.02英寸的范围内的ID。9.如权利要求1所述的方法，其中所述第一管具有约0.02英寸的ID并且所述第二管具有约0.01英寸的ID。10.如权利要求1所述的方法，其中所述第一管具有约0.03英寸的ID并且所述第二管具有约0.01英寸的ID。11.如权利要求2所述的方法，其中所述第一管具有在约0.01英寸至约0.08英寸的范围内的ID，并且所述第二管具有在约0.01英寸至约0.04英寸的范围内的ID。
12.如权利要求2所述的方法，其中所述第一管具有在约0.02英寸至约0.03英寸的范围内的ID，并且所述第二管具有在约0.01英寸至约0.02英寸的范围内的ID。13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中以约40mL/min至约375mL/min范围内的流速泵送所述水溶液。14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中以约10mL/min至约75mL/min范围内的流速泵送所述乙醇溶液。15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述输出溶液的总流速在约120mL/min至约300mL/min的范围内。16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述水溶液、乙醇和输出溶液维持在约10℃至约25℃的温度范围内...

【专利技术属性】
技术研发人员：包艳洁，布伦达，
申请(专利权)人：阿克丘勒斯治疗公司，
类型：发明
国别省市：