一种高通量DNA多位点精确碱基突变方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量DNA多位点精确碱基突变方法。本发明专利技术所提供的方法是基于重叠延伸PCR高通量对目标基因片段多位点高效引入突变的方法；所用引物不是简并引物，而是准确设计目标突变序列的突变引物；突变位点长度不限于单个氨基酸，可设计为连续1‑5个氨基酸；引物非单条分开合成，而是由寡核苷酸合成仪在集成芯片上批量合成，引物种类量级可达104‑105种类/批次；本发明专利技术所述突变方法可通过调节反应条件在一定程度上实现对突变频率的控制。本发明专利技术的突变建库方法可获得较高比例的有效突变体，建库突变体阳性率(非同义氨基酸突变)可达～80％；本发明专利技术所建的突变体库经过后续高通量筛选成为获得理想蛋白质及核酸改造体的有力工具。

A high-throughput DNA multisite precise base mutation method

The invention discloses a high-throughput DNA multi site precise base mutation method. The method provided in the present invention is based on a high throughput overlapping extension PCR method for introducing mutants into target gene fragments at multiple sites; the primers used are not degenerate primers, but mutant primers for accurately designing target mutation sequences; the length of mutant sites is not limited to a single amino acid, and can be designed as 1 to 5 consecutive amino acids; the primers are not degenerate primers. The mutation method of the invention can control mutation frequency to a certain extent by adjusting reaction conditions. The mutant library method of the invention can obtain a high proportion of effective mutants, and the mutant positive rate (non-synonymous amino acid mutation) can reach to 80%; The mutant library constructed by the invention is a powerful tool for obtaining ideal protein and nucleic acid modification after high throughput screening.

【技术实现步骤摘要】
一种高通量DNA多位点精确碱基突变方法
本专利技术涉及基因操作
，特别涉及一种高通量DNA多位点精确碱基突变方法，具体是一种基于重叠延伸PCR，使用精确设计的寡核苷酸芯片高通量合成的突变引物文库，向目标基因片段多位点同时引入突变的方法。
技术介绍
1967年Spiegelman等提出在体外分子水平定向进化生物分子的思想，定向进化技术是一种利用实验室手段通过反复多次改造遗传多样性，结合高通量文库筛选从而获得理想性状生物体的过程，现已成为蛋白质工程领域应用最广泛、最有效的技术之一。定向进化属于蛋白质的非合理设计范畴，与理性突变方法相比，突变体的构建无需受蛋白质空间结构信息和构效关系的限制，而是在体外模拟自然进化的过程(随机突变和选择)，在基因内部引入大量变异，并通过筛选实现在较短时间内定向选择出所需性质或功能的基因突变体。早期的定向进化技术的目标多是单个蛋白，基本用于蛋白质的研究和开发：通过随机或定点引入突变，以获得目的蛋白产量提高、蛋白催化活性提高或稳定性增强等突变体以满足生物催化及生物医药等领域的工业化需求。而近年来的趋势则转向于对整个代谢途径甚至在基因组水平进行改造，为有效合成有价值的生物产品构建新型的全细胞催化体系。易错PCR是应用最早、最成熟也是目前最常用的一项定向进化技术。其原理是在体外扩增基因时适当地调整PCR实验条件，使扩增过程层出现少量碱基错配而引入突变的诱变方法。可调整的条件如使用低保真度的Taq酶，采用突变酶，调整反应体系中4种dNTP比例，增加Mg2+浓度，加入Mn2+等。也可以组合多个条件以提高碱基错配的机率。该方法的优点是：易错PCR操作简单，无需额外合成特殊引物，且PCR过程中并未改变目标片段扩增长度，突变频率可在一定程度上通过调节反应条件进行相应的控制，另外，迭代易错PCR可使小的有益突变累积而获得较为理想的突变体。不足之处是：(1)易错PCR一般只会引入很小部分序列改变(以点突变为主)，因而一般适用于较小的基因片段(＜2kb)。(2)引入突变的随机性导致的大量同义突变、终止密码子突变及读码框破坏等大量的冗余突变使得易错PCR构建的突变文库有效率较低，有效突变体比例约占0.1-0.2％，增加了实验成本，造成了下游筛选实验的困难，难以获得理想突变体。1982年，加拿大著名科学家Smith等专利技术了寡聚核苷酸定点突变技术，为蛋白质工程领域的发展奠定了重要的基础。定点突变作为一种最基本的理性设计方案至今仍被广泛应用于各种蛋白质改造。然而定点突变技术面临的最重要的难题是如何从其它19种天然氨基酸中选出可以达到改造蛋白目标的最佳替换氨基酸。一系列研究表明，多点突变能获得比起单点突变有更高概率获得更理想的进化子，然而多点突变是定点突变不易直接获得的。针对这类问题，基于PCR的点饱和突变技术的开发由于其简单快速及易操作性而受到了广大研究者的青睐。基于PCR的点饱和突变方法的基本原理是在靶点处设计简并引物对目的基因进行扩增以达到获取突变子的目的。简并引物的突变位点一般计为NNN或NNX(N代表4种核苷酸等比例混合物；X代表2种核苷酸等比例混合物(如G/C或G/T)，同一位点的各种核苷酸替换不存在偏好性。基于PCR的点饱和突变方法主要分为以下两种：一种是突变引物诱变与重叠延伸PCR。当靶位点位于基因两端时，可设计正向引物为含有靶位点突变的简并引物，反向引物为与目的基因片段序列完全匹配的引物，以此引入突变。突变引物诱变是点饱和突变中最简单、最快速的方法，但难以对基因中间的靶位点实现点饱和突变。所以当靶位点位于基因中间时，可采用重叠延伸PCR：设计一对在靶位点附近有一定长度重叠的简并引物，将这两条引物分别与扩增基因全长的正反向引物组合，扩增包含突变靶位点的上下游片段。该法优点是：(1)可实现对基因中间的靶位点的点饱和突变；(2)可同时进行多点饱和突变。(3)基本不存在突变修复问题，提高产物中突变子比例；(4)突变与重组同时完成,一定程度可降低实验成本，缩短实验周期。不足之处是：(1)分别扩增上下游片段时，只能使用无加尾性能的高保真型或混合型DNA聚合酶，而不能使用具有无模板加尾性能的DNA聚合酶；(2)当靶位点靠近目的基因末端时，分段扩增的片段过小而不易回收，容易造成末端突变频率下降；(3)进行多点饱和突变时所需的简并引物数量较大，成本较高，且难以保证在有限实验次数内获得各点饱和突变子。另一种是质粒扩增诱变(反向PCR)。这种方法以含有目标基因的质粒为PCR扩增模板，在靶位点处设计一对完全互补的简并引物(或特定突变引物)，以反向PCR为基础，扩增质粒全长，然后用DpnI消化含甲基化位点的亲本质粒，保留由于没有甲基化位点而被保护的新合成片段，最终通过筛选获得携带目标突变的质粒。由于此法需要扩增质粒全长序列，因此在PCR反应中应特别注意扩增过程中的保真性，一般采用高保真型DNA聚合酶。目前已有研发单位及公司基于此方法开发了商业化的试剂盒，其中以Stratagene公司的QuickChange快速定点诱变试剂盒为代表。该法优点是：基于DNA体外杂交退火连接实现携带目标位点突变的PCR产物自环化以及基于大肠杆菌体内同源重组实现携带目标位点突变的PCR产物自环化的诱变方法省去了对PCR后的产物进行克隆的步骤，因此在一定程度上可以提高实验效率，降低实验成本。不足之处是：(1)因需要扩增质粒全长，PCR有效扩增效率低，耗时长，且易在非目标位置引入随机突变；(2)PCR扩增和诱变效率易受到质粒载体大小的影响，表现为较大的质粒载体不易扩增且诱变效率较低；(3)基于大肠杆菌体内同源重组环化PCR产物的方法虽然步骤简单，但需要后续DpnI酶消化处理或表达DpnI的特殊大肠杆菌菌株来实现模板质粒的消除，且需要根据实际实验优化相应的电转化条件才能获得较高的诱变效率；(4)因整体诱变效率偏低，该方法需要通过迭代诱变多次实验才可获得多点诱变，实验耗时成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速、高效的高通量对目标片段DNA多位点引入突变的方法。第一方面，本专利技术要求保护一种高通量对目标片段DNA多位点引入突变的方法。本专利技术所提供的高通量对目标片段DNA多位点引入突变的方法，具体可包括如下步骤：(1)根据目标片段DNA的序列，针对每个预突变位点及其对应的预突变结果分别设计单链寡核苷酸片段；所述单链寡核苷酸片段自5’端到3’端依次由上游接头序列、内切酶M的正向识别序列、突变引物、所述内切酶M的反向识别序列和下游接头序列组成；所述突变引物由对应于所述预突变位点的突变序列和位于所述目标片段DNA上所述预突变位点两侧的同源序列(即所述同源序列与所述目标片段DNA的所述预突变位点两侧的序列完全一致)组成。(2)合成步骤(1)所设计的单链寡核苷酸片段，获得包含所述突变引物序列的混合ssDNA文库。(3)以步骤(2)所得的混合ssDNA文库为模板，采用所述上游接头序列和所述下游接头序列作为引物对进行PCR扩增，然后采用所述内切酶M对所得PCR产物进行酶切处理，获得短双链突变引物文库。(4)利用所述目标片段DNA的全长上游引物和步骤(3)获得的短双链突变引物文库对所述目标片段DNA进行首轮TouchDownPCR，扩增20-2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量对目标片段DNA多位点引入突变的方法，包括如下步骤：(1)根据目标片段DNA的序列，针对每个预突变位点及其对应的预突变结果分别设计单链寡核苷酸片段；所述单链寡核苷酸片段自5’端到3’端依次由上游接头序列、内切酶M的正向识别序列、突变引物、所述内切酶M的反向识别序列和下游接头序列组成；所述突变引物由对应于所述预突变位点的突变序列和位于所述目标片段DNA上所述预突变位点两侧的同源序列组成；(2)合成步骤(1)所设计的单链寡核苷酸片段，获得包含所述突变引物序列的混合ssDNA文库；(3)以步骤(2)所得的混合ssDNA文库为模板，采用所述上游接头序列和所述下游接头序列作为引物对进行PCR扩增，然后采用所述内切酶M对所得PCR产物进行酶切处理，获得短双链突变引物文库；(4)利用所述目标片段DNA的全长上游引物和步骤(3)获得的短双链突变引物文库对所述目标片段DNA进行首轮TouchDown PCR，扩增20‑25个循环后得到一组产物，记为产物A；利用所述目标片段DNA的全长下游引物和步骤(3)获得的短双链突变引物文库对所述目标片段DNA进行首轮TouchDown PCR，扩增20‑25个循环后得到另一组产物，记为产物B；将所述产物A和所述产物B混合后继续进行5‑10个循环的第二轮TouchDown PCR，得到终产物；所述终产物中的DNA片段与所述目标片段DNA相比已被引入多位点突变。...

【技术特征摘要】
1.一种高通量对目标片段DNA多位点引入突变的方法，包括如下步骤：(1)根据目标片段DNA的序列，针对每个预突变位点及其对应的预突变结果分别设计单链寡核苷酸片段；所述单链寡核苷酸片段自5’端到3’端依次由上游接头序列、内切酶M的正向识别序列、突变引物、所述内切酶M的反向识别序列和下游接头序列组成；所述突变引物由对应于所述预突变位点的突变序列和位于所述目标片段DNA上所述预突变位点两侧的同源序列组成；(2)合成步骤(1)所设计的单链寡核苷酸片段，获得包含所述突变引物序列的混合ssDNA文库；(3)以步骤(2)所得的混合ssDNA文库为模板，采用所述上游接头序列和所述下游接头序列作为引物对进行PCR扩增，然后采用所述内切酶M对所得PCR产物进行酶切处理，获得短双链突变引物文库；(4)利用所述目标片段DNA的全长上游引物和步骤(3)获得的短双链突变引物文库对所述目标片段DNA进行首轮TouchDownPCR，扩增20-25个循环后得到一组产物，记为产物A；利用所述目标片段DNA的全长下游引物和步骤(3)获得的短双链突变引物文库对所述目标片段DNA进行首轮TouchDownPCR，扩增20-25个循环后得到另一组产物，记为产物B；将所述产物A和所述产物B混合后继续进行5-10个循环的第二轮TouchDownPCR，得到终产物；所述终产物中的DNA片段与所述目标片段DNA相比已被引入多位点突变。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，根据步骤(1)所设计的单链寡核苷酸片段的序列，利用DNA合成仪合成单链寡核苷酸片段并固定在用于制备芯片的固相载体上，合成结束后，将所述单链寡核苷酸片段从所述固相载体上脱离下来，获得包含所述突变引物序列的混合ssDNA文库。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，每个所述预突变位点为1个氨基酸的点突变或者为2-5个连续的氨基酸突变；和/或步骤(1)中，所述突变引物中的所述突变序列为3-15nt，两侧的所述同源序列为15-21nt。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，还包括按照如下在所述突变引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：席建忠，朱丹，王干诚，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11