一种从人母乳样本中提取微生物MetaDNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种从人母乳样本中提取微生物MetaDNA的方法，包括以下步骤：步骤一，提取母乳样本；步骤二，离心浓缩样本；步骤三，裂解样本；步骤四，离心柱结合；步骤五，高盐溶液洗涤；步骤六，洗涤静置；步骤七：DNA回溶。本发明专利技术通过使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit DNA快速提取试剂盒，不会影响样本中DNA的提取量、完整性、肠道菌群丰度和多样性指数的检测结果，保证了数据的准确性，通过使用市面上常见的QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒，进行提取流程的优化和改进，最终提取出母乳中的微生物Meta DNA，并且通过PCR进行了鉴定，以证明该方案的可行，本发明专利技术的提取成功率极高，保证了实验数据的准确性，极大的提高了提取过程的效率，同时减少了不必要的资源浪费。

A method for extracting microbial MetaDNA from human breast milk samples

The invention discloses a method for extracting microbial metaDNA from human breast milk samples, which comprises the following steps: step 1, extracting breast milk samples; step 2, centrifuging and concentrating the samples; step 3, splitting the samples; step 4, combining the centrifugal column; step 5, washing the high salt solution; step 6, washing and standing; step 7: DNA: centrifuging and concentrating the samples. Resolve. By using the QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit DNA rapid extraction kit, the method does not affect the detection results of the DNA extraction amount, integrity, intestinal flora abundance and diversity index in the sample, and ensures the accuracy of the data. By using the commonly used QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit kit on the market, the method can be used for the detection of the intestinal flora abundance and diversity index. The extraction process is optimized and improved, and the microbial Meta DNA in the breast milk is finally extracted and identified by PCR to prove the feasibility of the scheme. The method has high extraction success rate, ensures the accuracy of experimental data, greatly improves the efficiency of the extraction process, and reduces unnecessary resources. Waste.

【技术实现步骤摘要】
一种从人母乳样本中提取微生物MetaDNA的方法
本专利技术涉及母乳样本提取的方法，特别涉及一种从人母乳样本中提取微生物MetaDNA的方法。
技术介绍
人类乳汁中含有丰富的营养成分和保护因子，对于新生儿的成长和发育至关重要。此外母乳中有高达数百种细菌,而且包括一些常见的病原菌。现有的研究认为母乳是影响新生儿肠道发育和免疫系统成熟的关键因素，其中微生物起到了至关重要的作用。母乳中的微生物具有抑制其他有害病原菌的生长，调节免疫系统，帮助消化，保护肠道健康等多种有益作用。但是，另一方面，如果母亲自身携带一些传染性疾病或病毒，极大可能会通过哺乳传染给婴儿。例如，如果母亲为乙型肝炎病毒(HBV)携带者，可能会通过喂养导致新生儿感染乙型病毒性肝炎，中国每年约有80万儿童通过乳汁感染而成为HBV携带者，约占中国婴幼儿HBV感染的1/3。因此对于母乳中微生物的种类、来源及作用，对新生儿肠道健康、抗生素替代、及临床疾病的预防等研究均有着重要的作用，因此，专利技术一种从人母乳样本中提取微生物MetaDNA的方法来解决上述问题很有必要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从人母乳样本中提取微生物MetaDNA的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种从人母乳样本中提取微生物MetaDNA的方法，包括以下步骤：步骤一，提取母乳样本：将母乳样本放置在样本微生物提取试剂盒中存储，并分装40μL蛋白酶K至一个灭菌的2.0ml离心管中；步骤二，离心浓缩样本：a:室温解冻母乳样本，震荡混匀，准备另一个新的灭菌的2.0ml离心管分装1ml的母乳样本，85mg样本在微量离心机中离心10min；b:离心后，样本将分为三层，最上层为黄白色的脂肪层，中间为澄清的液体，最下层为白色的沉淀，吸取800μL样本中间层到分装好的蛋白酶K的离心管中，上下颠倒混匀；步骤三，裂解样本：a:向离心浓缩完成后的混合溶液中加入800μLBufferAL，涡旋震荡，充分混匀15s；b:使用加热器70℃孵育10min；c:从加热器中取出样本管，震荡混匀，分装成两管，每管820μL；d:每管样本加入820μL无水乙醇，涡旋震荡15s充分混匀，放入-20℃冰箱冷处理15min；步骤四，离心柱结合：将冷处理后的样本溶液转移700μL至纯化柱中过柱，12500rcf离心30s，离心后弃废液和收集管，转移纯化柱至新的收集管中，继续将冷处理后的样本溶液转移700μL至纯化柱中过柱，直至溶液全部过柱；步骤五，高盐溶液洗涤：a:向纯化柱中加入500μLBufferAW1，20000rcf离心1min,弃去废液和收集管，转移纯化柱至一个新的收集管中；b:向纯化柱中加入500μLBufferAW2，20000rcf离心1min，弃去废液和收集管，转移纯化柱至一个新的收集管中；步骤六，洗涤静置：a:对收集管进行空甩，20000rcf离心2min，将纯化柱转移至新的贴好标签的1.5ml离心管中，室温晾干3min；b:吸取32μLEB溶液到纯化柱底部，室温静置2min；步骤七：DNA回溶：将纯化柱和离心管在20000rcf下离心2min，离心后取下装有DNA溶液的离心管，标记好后于-20℃保存。优选的，样本微生物提取试剂盒QIAampFastDNAStoolMiniKitDNA快速提取试剂盒，收取完成后放置在2-8℃下进行保存。优选的，步骤二中微量离心机工作效率为2000-3000r/min。优选的，步骤六中EB溶液提前在70℃下预热，预热时间为5-10min。本专利技术的技术效果和优点：通过使用QIAampFastDNAStoolMiniKitDNA快速提取试剂盒，不会影响样本中DNA的提取量、完整性、肠道菌群丰度和多样性指数的检测结果，保证了数据的准确性，通过使用市面上常见的QIAampFastDNAStoolMiniKit试剂盒，进行提取流程的优化和改进，最终提取出母乳中的微生物MetaDNA，并且通过PCR进行了鉴定，以证明该方案的可行，本专利技术的提取成功率极高，保证了实验数据的准确性，极大的提高了提取过程的效率，同时减少了不必要的资源浪费。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供了一种从人母乳样本中提取微生物MetaDNA的方法，包括以下步骤：步骤一，提取母乳样本：将母乳样本放置在样本微生物提取试剂盒中存储，并分装40μL蛋白酶K至一个灭菌的2.0ml离心管中，样本微生物提取试剂盒QIAampFastDNAStoolMiniKitDNA快速提取试剂盒，收取完成后放置在2-8℃下进行保存；步骤二，离心浓缩样本：a:室温解冻母乳样本，震荡混匀，准备另一个新的灭菌的2.0ml离心管分装1ml的母乳样本，85mg样本在微量离心机中离心10min，微量离心机工作效率为2000-3000r/min；b:离心后，样本将分为三层，最上层为黄白色的脂肪层，中间为澄清的液体，最下层为白色的沉淀，吸取800μL样本中间层到分装好的蛋白酶K的离心管中，上下颠倒混匀；步骤三，裂解样本：a:向离心浓缩完成后的混合溶液中加入800μLBufferAL，涡旋震荡，充分混匀15s；b:使用加热器70℃孵育10min；c:从加热器中取出样本管，震荡混匀，分装成两管，每管820μL；d:每管样本加入820μL无水乙醇，涡旋震荡15s充分混匀，放入-20℃冰箱冷处理15min；步骤四，离心柱结合：将冷处理后的样本溶液转移700μL至纯化柱中过柱，12500rcf离心30s，离心后弃废液和收集管，转移纯化柱至新的收集管中，继续将冷处理后的样本溶液转移700μL至纯化柱中过柱，直至溶液全部过柱；步骤五，高盐溶液洗涤：a:向纯化柱中加入500μLBufferAW1，20000rcf离心1min,弃去废液和收集管，转移纯化柱至一个新的收集管中；b:向纯化柱中加入500μLBufferAW2，20000rcf离心1min，弃去废液和收集管，转移纯化柱至一个新的收集管中；步骤六，洗涤静置：a:对收集管进行空甩，20000rcf离心2min，将纯化柱转移至新的贴好标签的1.5ml离心管中，室温晾干3min；b:吸取32μLEB溶液到纯化柱底部，室温静置2min，EB溶液提前在70℃下预热，预热时间为5-10min；步骤七：DNA回溶：将纯化柱和离心管在20000rcf下离心2min，离心后取下装有DNA溶液的离心管，标记好后于-20℃保存。通过上述实施例进行实验后，提取母乳样本346个，一次提取成功率：97.7％；8个提取失败样本进行重提，二次提取成功率100％。提取后的样本进行细菌的16srDNA的V3+V4区域建库，其中337个建库成功，9个建库失败，建库成功率97.4％，建库产物检测示意图如说明书附图(挑选2个)：图1和图2图1和图2是对母乳中的微生物DNA进行16srDNA区域扩增的示意图，图中显示均扩增成功，而且无非特异性扩增，表明提取出的DNA确实为微本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从人母乳样本中提取微生物MetaDNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一，提取母乳样本：将母乳样本放置在样本微生物提取试剂盒中存储，并分装40μL蛋白酶K至一个灭菌的2.0ml离心管中；步骤二，离心浓缩样本：a:室温解冻母乳样本，震荡混匀，准备另一个新的灭菌的2.0ml离心管分装1ml的母乳样本，85mg样本在微量离心机中离心10min；b:离心后，样本将分为三层，最上层为黄白色的脂肪层，中间为澄清的液体，最下层为白色的沉淀，吸取800μL样本中间层到分装好的蛋白酶K的离心管中，上下颠倒混匀；步骤三，裂解样本：a:向离心浓缩完成后的混合溶液中加入800μL Buffer AL，涡旋震荡，充分混匀15s；b:使用加热器70℃孵育10min；c:从加热器中取出样本管，震荡混匀，分装成两管，每管820μL；d:每管样本加入820μL无水乙醇，涡旋震荡15s充分混匀，放入‑20℃冰箱冷处理15min；步骤四，离心柱结合：将冷处理后的样本溶液转移700μL至纯化柱中过柱，12500rcf离心30s，离心后弃废液和收集管，转移纯化柱至新的收集管中，继续将冷处理后的样本溶液转移700μL至纯化柱中过柱，直至溶液全部过柱；步骤五，高盐溶液洗涤：a:向纯化柱中加入500μL Buffer AW1，20000rcf离心1min,弃去废液和收集管，转移纯化柱至一个新的收集管中；b:向纯化柱中加入500μL Buffer AW2，20000rcf离心1min，弃去废液和收集管，转移纯化柱至一个新的收集管中；步骤六，洗涤静置：a:对收集管进行空甩，20000rcf离心2min，将纯化柱转移至新的贴好标签的1.5ml离心管中，室温晾干3min；b:吸取32μL EB溶液到纯化柱底部，室温静置2min；步骤七：DNA回溶：将纯化柱和离心管在20000rcf下离心2min，离心后取下装有DNA溶液的离心管，标记好后于‑20℃保存。...

【技术特征摘要】
1.一种从人母乳样本中提取微生物MetaDNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一，提取母乳样本：将母乳样本放置在样本微生物提取试剂盒中存储，并分装40μL蛋白酶K至一个灭菌的2.0ml离心管中；步骤二，离心浓缩样本：a:室温解冻母乳样本，震荡混匀，准备另一个新的灭菌的2.0ml离心管分装1ml的母乳样本，85mg样本在微量离心机中离心10min；b:离心后，样本将分为三层，最上层为黄白色的脂肪层，中间为澄清的液体，最下层为白色的沉淀，吸取800μL样本中间层到分装好的蛋白酶K的离心管中，上下颠倒混匀；步骤三，裂解样本：a:向离心浓缩完成后的混合溶液中加入800μLBufferAL，涡旋震荡，充分混匀15s；b:使用加热器70℃孵育10min；c:从加热器中取出样本管，震荡混匀，分装成两管，每管820μL；d:每管样本加入820μL无水乙醇，涡旋震荡15s充分混匀，放入-20℃冰箱冷处理15min；步骤四，离心柱结合：将冷处理后的样本溶液转移700μL至纯化柱中过柱，12500rcf离心30s，离心后弃废液和收集管，转移纯化柱至新的收集管中，继续将冷处理后的样本溶液转移700μL至纯化柱中过柱，直至溶液全部过柱；步骤五，高盐溶液洗涤：a:向纯化柱...

【专利技术属性】
技术研发人员：张哲，傅延，张慧，徐子静，
申请(专利权)人：安徽微分基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34