一种基于PARMS技术的纳升级超高通量SNP基因分型方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，且公开了一种基于PARMS技术的纳升级超高通量SNP基因分型方法，包括以下步骤：S1、准备PARMS试剂，按照说明书进行引物稀释及混合，配制成Primer mix试剂；S2、将样本按照一定的浓度均一化；S3、准备1块384孔板，标注为Sample板，按照MSND 96Samples*54Assays模式要求，每孔加入2

【技术实现步骤摘要】
一种基于PARMS技术的纳升级超高通量SNP基因分型方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体为一种基于PARMS技术的纳升级超高通量SNP基因分型方法。

技术介绍

[0002]SNP，全称Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因组上单个核苷酸的变异而引起的一种DNA序列多态性，即单核苷酸多态性。SNP研究具有重要的生物学意义和广泛的应用，在农业领域中，可以进行性状基因的精细定位、分子辅助育种、种子资源鉴定等；在医学领域或临床应用中，主要有疾病的分子遗传机制研究、疾病基因定位、肿瘤及癌症筛查、药物敏感或疾病易感位点筛查等。
[0003]SNP基因分型技术原理是PCR扩增含有SNP的基因组片段，主要特点是准确性高、灵活性强、通量大，目前实验室主要采用的方法有 TaqMan探针法、KASP技术。TaqMan探针法是针对基因组上的不同SNP 位点分别设计PCR引物和能够识别单个核苷酸差异位点的TaqMan探针，进行实时荧光PCR扩增，通过探针的荧光标记来识别SNP位点。 KASP是通过touch-down PCR方法，针对基因组上的不同SNP位点分别设计能够识别单个核苷酸差异位点特异PCR引物和通用荧光探针，通过两轮PCR过程，进行实时荧光PCR扩增，通过探针的荧光标记来识别SNP位点。由于荧光探针的合成费用高，TaqMan探针法需要针对单个SNP位点来设计合成探针，时间成本和试剂成本都很高，而 KASP通过批量合成通用探针，可重复使用，节约时间和成本。PARMS 技术原理和KASP类似，但PARMS试剂成本更低且分型的成簇效果更好，易于检测机器软件的自动判读，减少人为判读的误判。PARMS技术结合Takara SmartChip
TM
Real-Time PCR System，可以将检测反应通量提升到5184个，且每个反应只需要100nl，极大节约了反应试剂和样本。

技术实现思路

[0004](一)解决的技术问题
[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于PARMS技术的纳升级超高通量SNP基因分型方法，解决了上述
技术介绍
中所提出的问题。
[0006](二)技术方案
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于PARMS技术的纳升级超高通量SNP基因分型方法，包括以下步骤：
[0008]S1、准备PARMS试剂，按照说明书进行引物稀释及混合，配制成 Primer mix试剂；
[0009]S2、将样本按照一定的浓度均一化；
[0010]S3、准备1块384孔板，标注为Sample板，按照MSND 96Sampl es*54Assays模式要求，每孔加入2
×
PARMS master mix，均一化样本，然后补水到一定量；
[0011]S4、将Sample板进行离心，放在MSND上384孔板放置区，取1 块空芯片放置在芯片载台上，自动分配样本到芯片孔内，完成后芯片封中间膜，在合适的温度条件下进行离心，
芯片需要在一定的温度条件下保存；
[0012]S5、准备1块384孔板，标注为Assay板，按照MSND 96Sample s*54Assays模式要求，每孔加入2
×
PARMS master mix，Primer mi x，2％BSA，50mM MgCl2，然后补水到一定量；
[0013]S6、将Assay板进行离心，放在MSND上384孔板放置区，取步骤4的芯片，撕掉中间膜放置在芯片载台上，MSND自动分配试剂到芯片孔内，完成后芯片封qPCR膜，在合适的温度条件下进行离心后， qPCR上机检测；
[0014]S7、qPCR完成后，软件会自动分析出SNP分型结果。
[0015]优选的，所述步骤S2中的样本浓度为10ng/μl。
[0016]优选的，所述步骤S3中的2
×
PARMS master mix量为7.2μl，均一化后的样本量为2.88μl，补水到14.4μl。
[0017]优选的，所述步骤S5中2
×
PARMS master mix、Primer mix、 2％BSA和50mM MgCl2的量分别为8.5μl、3.4μl、1.7μl和0.68μl，补水到17μl。
[0018]优选的，所述步骤S4和所述步骤S6中的Sample板和Assay板的离心条件均为2200rcf离心2min，所述步骤S4和所述步骤S6中的芯片的离心条件均为4℃条件下2200rcf离心5min。
[0019]优选的，所述步骤S4中的芯片需要在4℃条件下保存。
[0020]优选的，所述步骤S6中的qPCR程序设置为：
[0021]第一步：57℃、1min(收集荧光)；
[0022]第二步：94℃、10min；
[0023]第三步：94℃、20s；
[0024]第四步：65℃、1min；
[0025]第五步：回到第三步，10个循环，每个循环降温0.8℃；
[0026]第六步：94℃、20s；
[0027]第七步：57℃、1min(收集荧光)；
[0028]第八步：回到第五步，30个循环；
[0029]第九步：57℃、1mmin(收集荧光)。
[0030](三)有益效果
[0031]本专利技术提供了一种基于PARMS技术的纳升级超高通量SNP基因分型方法，具备以下有益效果：
[0032]本专利技术通过使用PARMS技术，在Wafergen Smartchip纳升级超高通量QPCR平台检测42个样本的3个位点的基因型(42个样本3 个位点基因型已知：均为21个纯合基因型、21个杂合基因型)，检测结果证明该方法SNP分型效果良好，结果判读与已知基因型完全一致，检测成功率达100％。并进行二次重复性测试，两次分型结果一致率100％；与传统实时荧光定量PCR平台相比，Wafergen SmartChip 纳升级超高通量QPCR平台拥有三大优势。其一，在相同时间内， Wafergen SmartChip平台最高通量高达5184个反应，相对传统实时荧光定量PCR平台通量96或384个反应，通量提升13.5～54倍。其二，Wafergen Smartchip平台100纳升级体系与常规QPCR 20微升体系相比，大大节约了样本和试剂用量，换而言之，相同的样本量在 Wafergen SmartChip平台可检测更多的SNP位点。其三，WafergenSmartChip平台自动化程度高，人员操作内容少，不仅大大减少了板间差异、保证了良好的均一性，同时节
约了人力成本和时间成本；与传统Taqman探针分型技术相比，在保证分型准确性的前提下，独特的PARMS分型技术使试剂成本节约60％。
具体实施方式
[0033]对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于PARMS技术的纳升级超高通量SNP基因分型方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、准备PARMS试剂，按照说明书进行引物稀释及混合，配制成Primer mix试剂；S2、将样本按照一定的浓度均一化；S3、准备1块384孔板，标注为Sample板，按照MSND 96Samples*54As says模式要求，每孔加入2
×
PARMS master mix，均一化样本，然后补水到一定量；S4、将Sample板进行离心，放在MSND上384孔板放置区，取1块空芯片放置在芯片载台上，自动分配样本到芯片孔内，完成后芯片封中间膜，在合适的温度条件下进行离心，芯片需要在一定的温度条件下保存；S5、准备1块384孔板，标注为Assay板，按照MSND 96Samples*54Ass ays模式要求，每孔加入2
×
PARMS master mix，Primer mix，2％BSA，50mM MgCl2，然后补水到一定量；S6、将Assay板进行离心，放在MSND上384孔板放置区，取步骤4的芯片，撕掉中间膜放置在芯片载台上，MSND自动分配试剂到芯片孔内，完成后芯片封qPCR膜，在合适的温度条件下进行离心后，qPCR上机检测；S7、qPCR完成后，软件会自动分析出SNP分型结果。2.根据权利要求1所述的一种基于PARMS技术的纳升级超高通量SNP基因分型方法，其特征在于：所述步骤S2中的样本浓度为10ng/μl。3.根据权利要求1所述的一种基于PARMS技术的纳升级超高通量SN...

【专利技术属性】
技术研发人员：张茹松，李西清，张鸿，赵琨，
申请(专利权)人：安徽微分基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：