The invention discloses a full-length cDNA synthesis method and the construction of its sequencing library. The method consists of the following steps: (1) Total RNA extraction; (2) Total RNA synthesis by Oligo dT primers and long-chain reverse transcriptase; (3) the first-stranded cDNA in step (2) is used as a template and linked by ligase; (4) the first-stranded cDNA is linked by ligase; (3) the first-stranded cDNA is synthesized by Oligo dT primers and long-stranded reverse transcriptase. A full-length double-stranded cDNA was obtained by double-stranded enrichment of the first-stranded cDNA with a double-linked head. A full-length cDNA without fragmentation was synthesized by this method, and the sequencing library was constructed. At the same time, the incomplete or degraded 5'end of the RNA sequence would not occur, which avoided affecting the subsequent analysis.
【技术实现步骤摘要】
一种全长cDNA合成方法及其测序文库的构建
本专利技术涉及分子生物
,具体涉及一种全长cDNA合成方法及其测序文库的构建。
技术介绍
NGS测序技术又称下一代测序,其优点是测序通量高,周期短,成本低。RNA-seq又称转录组测序技术,即用高通量测序技术把编码RNA、非编码RNA(noncodingRNA)等或把其中的某些RNA的序列测出来,以检测它们的表达水平。通常,在构建RNA测序文库时,首先需要分离纯化相关的RNA样本,然后再将相关的RNA样本进行片段化处理,并通过逆转录合成cDNA,最后通过建库上机进行测序。Iso-Seq又称全长转录组测序,优点是读长长,所测数据基本不需组装,可以直接进行后续相关分析。在cDNA合成过程中,RNA样本无需片段化处理,直接进行全长cDNA的合成。但是由于目前现有的技术和方法无法识别和区分mRNA样本的完整性,对于5’端已降解的mRNA也会进行全合成,最终测得的数据会包含全长的转录本数据和非全长的转录本数据,后续的分析也很难判断其是否为真正意义上的全长。
技术实现思路
本专利技术的目的在于,针对上述现有技术的不足,提出一种全长cDNA合成方法,得到一种全长cDNA,无需片段化处理即可构建测序文库。本专利技术提出一种全长cDNA合成方法,其特征在于:包括以下步骤:(1)TotalRNA的提取;取真核生物的组织、细胞或者血液等样本,进行总RNA的提取。(2)将步骤(1)中提取的所述TotalRNA通过OligodT引物和长链逆转录酶的作用下合成第一链cDNA;第一链cDNA链的合成是在OligodT引物以及长链逆转录酶的作 ...
【技术保护点】
1.一种全长cDNA合成方法,其特征在于:包括以下步骤:(1)Total RNA的提取;(2)将步骤(1)中提取的所述Total RNA通过Oligo dT引物和长链逆转录酶的作用下合成第一链cDNA;(3)将步骤(2)中所述第一链cDNA作为模板,通过连接酶进行双链接头的连接;(4)将步骤(3)中的连接有双链接头的所述第一链cDNA在聚合酶的作用下进行双链富集,得到一种全长双链cDNA。
【技术特征摘要】
1.一种全长cDNA合成方法,其特征在于:包括以下步骤:(1)TotalRNA的提取;(2)将步骤(1)中提取的所述TotalRNA通过OligodT引物和长链逆转录酶的作用下合成第一链cDNA;(3)将步骤(2)中所述第一链cDNA作为模板,通过连接酶进行双链接头的连接;(4)将步骤(3)中的连接有双链接头的所述第一链cDNA在聚合酶的作用下进行双链富集,得到一种全长双链cDNA。2.如权利要求1所述的一种全长cDNA合成方法,其特征在于:步骤(1)中采用Trizol提取方式进行TotalRNA的提取。3.如权利要求1所述的一种全长cDNA合成方法,其特征在于:步骤(2)中所述OligodT引物序列为5’-TCTCAGGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。4.如权利要求1所述的一种全长cDNA合成方法,其特征在于:步骤(2)中所述长链逆转录...
【专利技术属性】
技术研发人员:王邹,章高迪,杨帆,丁琼,郝升,丁悦,郭静,
申请(专利权)人:武汉光谷创赢生物技术开发有限公司,
类型:发明
国别省市:湖北,42
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