一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵及喷雾干燥方法技术

本发明专利技术公开了一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵及喷雾干燥方法，该方法是将枯草芽孢杆菌种子液接入发酵培养基中进行发酵培养，通过双阶段控温调控和补料分批发酵技术提高枯草芽孢杆菌的活菌浓度，获得高密度菌液；然后在高密度菌液中添加干燥保护剂，混合均匀后进行喷雾干燥制得枯草芽孢杆菌干粉制剂。该方法工艺简便、操作简单、易于控制，成本低廉，适合大规模工业化生产。本发明专利技术制得的干粉制剂具有活菌浓度高、芽孢率高、繁殖性好等优点，可以有效改善水体的微生态环境，净化水体水质，保护水环境。

A high density fermentation and spray drying method for Bacillus subtilis

The invention discloses a high density fermentation and spray drying method for Bacillus subtilis. The method is to ferment and culture Bacillus subtilis seed liquid into fermentation medium, improve the living bacteria concentration of Bacillus subtilis by double stage temperature control control and feed batch fermentation technology, and obtain high density bacterial liquid. Drying agent was added to the high density bacteria solution, and then dried evenly and spray dried to make the dry powder preparation of Bacillus subtilis. The method is simple, simple to operate, easy to control and low in cost, and suitable for large-scale industrial production. The dry powder preparation made by the invention has the advantages of high living bacteria concentration, high sporulation rate and good reproduction, and can effectively improve the micro ecological environment of water body, purify water quality and protect the water environment.

【技术实现步骤摘要】
一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵及喷雾干燥方法
本专利技术属于环境微生物发酵
，具体涉及一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵及喷雾干燥方法。
技术介绍
随着我国水产养殖生产规模不断扩大，养殖集约化程度逐年提高，水体环境亦日趋恶化。养殖过程中累积的大量残饵、粪便及死亡动植物沉于水中，加重了水体中氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐、硫化物等有害物质的积累，使得水体中的富营养化程度越来越高。受限于水体自身的净化与调节能力，污染水体造成水生态严重失衡，促使病原菌大量生长繁殖，水质严重恶化，而污染水源则通过水体流动导致邻近区域甚至更大面积的水体富营养化，从而引发大面积的水体病虫害，严重破坏水体生产活动，威胁人类健康生活。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，是枯草芽孢杆菌属的一种。它是一种好氧的革兰氏阳性菌，广泛地分布在自然界中，对人畜无毒、无害。枯草芽孢杆菌在水中繁殖后能抑制水体中的弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害微生物，有效预防水产动物肠炎，烂鳃等疾病；同时，它分泌大量的胞外酶如几丁质酶能分解病原真菌的细胞壁和水体中残饵、粪便、有机物等有毒有害物质，从而达到清理水中垃圾小颗粒及改善有害蓝藻泛溢造成的水质浑浊的目的。通过枯草芽孢杆菌降解水中的富余有机物，可使水体中的氨氮和硝基氮减少80％以上，有效地稳定了水体中各项理化指标，维持了水生态平衡。因此，使用枯草芽孢杆菌制剂来改善水体的微生态环境，净化水体水质，被越来越多地应用于水环境治理中。另外，枯草芽孢杆菌还具有较好的蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶活性，生物夺氧能力强，可以提高饲料转化率和促进动物生长，因此也用于饲料用微生态制剂。枯草芽孢杆菌发酵是一种复杂的生理代谢过程，发酵结果的好坏除了与菌种和种子液的质量有关系外，发酵培养基的组成比例和代谢调控过程是关键因素。现有的枯草芽孢杆菌制剂生产方法中，发酵培养基组分单一，工艺控制过于简单，得到的活菌浓度较低，且芽孢转化率低。现有的干燥技术一般采用冷冻干燥技术或者低温干燥技术，且干燥前需要通过离心或过滤手段浓缩菌液或菌体，其生产周期长，增加了制备工序的复杂性和不确定性，也进一步导致干燥后菌粉制剂中菌体的存活率较低，实际使用效果不理想，不利于大规模推广应用。喷雾干燥法是一种利用热空气对雾化物料进行干燥的方法，工艺简便、操作简单、成本低廉，在大规模工业生产中应用较多；但是，喷雾干燥过程中产生的高温会对热敏性物料造成不可逆转的破坏。
技术实现思路
本专利技术为克服上述现有技术所述的问题，提供了一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵及喷雾干燥方法，该方法制备工艺简单可控，缩短了生产周期，制得的枯草芽孢杆菌具有发酵活菌数高、芽孢转化率高、喷雾干燥存活率高的优点。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵及喷雾干燥方法，包括如下步骤：(a)、菌种活化：将在4℃温度下斜面保存的枯草芽孢杆菌划线于NA培养基上，于30～37℃培养20～30h；(b)、种子液制备：挑取活化的菌落，接种到灭菌后的肉汤培养基中，于30～37℃、150～220rpm恒温振荡摇床培养20～30h，制成种子液；(c)、发酵罐培养：将制备好的枯草芽孢杆菌种子液以1～10％的接种比例移入装有发酵培养基的发酵罐中；发酵过程中采用补料分批发酵控制方法：在发酵第6h前流加葡萄糖液维持5～10g/L残糖浓度；同时补加酸性pH调节剂或碱性pH调节剂使发酵液pH维持在6.5～8.0范围；其它发酵条件为：通气量1～3:1VVM，温度30～37℃，搅拌转速200～600rpm，罐压0.03～0.07MPa，发酵时间20～30h；得到高密度发酵菌液；(d)、喷雾干燥：在高密度发酵菌液中加入2～10％(w/v)的保护剂，搅拌均匀后进行干燥；喷雾干燥条件为：进风口温度150～180℃，出风口温度70～90℃，进料速度1～3L/h；收集得到枯草芽孢杆菌干粉制剂。优选地，步骤(c)中，自初始状态到发酵罐内活菌数达到稳定状态的发酵阶段，发酵罐内的温度控制在34～37℃；发酵罐内的活菌数达到稳定状态至放罐阶段，发酵罐内的温度控制在30℃～34℃。优选地，步骤(d)中，所述保护剂选自玉米淀粉、蔗糖、糊精、乳糖、碳酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、聚天冬氨酸、脱脂乳粉、海藻糖中的至少一种。进一步优选地，步骤(d)中，发酵菌液中加入的所述保护剂为1.8％碳酸钙、3.2％微晶纤维素、2％聚天冬氨酸。优选地，步骤(c)中所述发酵培养基的组分为：玉米淀粉5～15g/L，蛋白胨1～5g/L，酵母粉1～5g/L，NaCl5～10g/L，消泡剂1～5g/L，余量为水；所述发酵培养基的消后pH为6.5～7.5。优选地，所述消泡剂为聚醚类、有机硅类、聚醚改性硅类中的至少一种。优选地，步骤(c)中，所述酸性pH调节剂选自于浓度为5～10wt％的稀盐酸或稀硫酸或稀磷酸，碱性pH调节剂选自于浓度为5～10wt％的氨水或10～20wt％氢氧化钠。优选地，步骤(b)中，所述肉汤培养基的灭菌条件为115～121℃，保温时间为15～30min，消前pH为6.5～7.5。本专利技术步骤(c)中得到的发酵菌液的枯草芽孢杆菌活菌数浓度≥150亿cfu/mL，芽孢转化率≥97％。本专利技术喷雾干燥制得的枯草芽孢杆菌干粉制剂的枯草芽孢杆菌活菌数浓度≥1000亿cfu/g，菌种存活率高于85％。以上制备方法中活菌和芽孢干粉计数采用平板稀释涂布法检测。本专利技术发酵过程中采用补料分批发酵控制方法，通过对菌种活化、种子液制备的工艺以及发酵条件中各工艺参数的调整和选择，发现了一种工艺简单可控的生产方法。通过对发酵工艺的控制，采用补料分批发酵的方法，尤其是对发酵温度和流加葡萄糖的浓度及时间进行优选和精确控制，配合合适的通气量和压力，可以制备高密度发酵菌液，所制得的枯草芽孢杆菌活菌数高、芽孢转化率高。通过在干燥时加入物料保护剂和对喷雾干燥工艺的调整选择，使得制得的枯草芽孢杆菌干粉制剂具有活菌存活率高的优点；该工艺干燥前无需离心或浓缩处理，简化了生产工序，缩短了生产周期，且对芽孢的损伤小，干燥后的枯草芽孢杆菌制剂以均匀固体粉末形态存在，既方便储藏、运输及使用，也可以有效地保证产品的稳定性与可靠性。本专利技术对保护剂的种类和添加量进行了优选，可以大大降低喷雾干燥时高温对物料造成的不利影响，提高活菌的存活率，并且可以提高产品的稳定性。本专利技术还对发酵培养基的组分包括消泡剂的组分都进行了优选，优选的发酵培养基一方面可以更好地为枯草芽孢杆菌提供所需要的碳源、氮源、无机盐等营养物质，加快其生长速度，缩短发酵周期，提高芽孢转化率和活菌密度；另一方面所述发酵培养基和保护剂配合还可以提高喷雾干燥工艺中枯草芽孢杆菌对高温和压力的耐受能力，进一步提高其活菌存活率，且产品存放稳定性更好。本专利技术还优化了发酵过程中的温度控制，采用双阶段控温技术联合补料分批发酵技术，可以提高发酵液中枯草芽孢杆菌的活菌总数和芽孢转化率。本专利技术还优化了pH调节剂的种类和浓度以及肉汤培养基的灭菌条件，进一步保证了生产工艺的稳定可控，保证枯草芽孢杆菌的繁殖速度和提高芽孢转化率，缩短生产周期。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)无需离心或浓缩处理，简化了生产工序，缩短了生产周期，工艺简单，生产成本低；(2)枯草芽孢杆菌活本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵及喷雾干燥方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)、菌种活化：将在4℃温度下斜面保存的枯草芽孢杆菌划线于NA培养基上，于30～37℃培养20～30h；(b)、种子液制备：挑取活化的菌落，接种到灭菌后的肉汤培养基中，于30～37℃、150～220rpm恒温振荡摇床培养20～30h，制成种子液；(c)、发酵罐培养：将制备好的枯草芽孢杆菌种子液以1～10％的接种比例移入装有发酵培养基的发酵罐中；发酵过程中采用补料分批发酵控制方法：在发酵第6h前流加葡萄糖液维持5～10g/L残糖浓度；同时补加酸性pH调节剂或碱性pH调节剂使发酵液pH维持在6.5～8.0范围；其它发酵条件为：通气量1～3:1VVM，温度30～37℃，搅拌转速200～600rpm，罐压0.03～0.07MPa，发酵时间20～30h；得到高密度发酵菌液；(d)、喷雾干燥：在高密度发酵菌液中加入2～10％w/v的保护剂，搅拌均匀后进行干燥；喷雾干燥条件为：进风口温度150～180℃，出风口温度70～90℃，进料速度1～3L/h；收集得到枯草芽孢杆菌干粉制剂。

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵及喷雾干燥方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)、菌种活化：将在4℃温度下斜面保存的枯草芽孢杆菌划线于NA培养基上，于30～37℃培养20～30h；(b)、种子液制备：挑取活化的菌落，接种到灭菌后的肉汤培养基中，于30～37℃、150～220rpm恒温振荡摇床培养20～30h，制成种子液；(c)、发酵罐培养：将制备好的枯草芽孢杆菌种子液以1～10％的接种比例移入装有发酵培养基的发酵罐中；发酵过程中采用补料分批发酵控制方法：在发酵第6h前流加葡萄糖液维持5～10g/L残糖浓度；同时补加酸性pH调节剂或碱性pH调节剂使发酵液pH维持在6.5～8.0范围；其它发酵条件为：通气量1～3:1VVM，温度30～37℃，搅拌转速200～600rpm，罐压0.03～0.07MPa，发酵时间20～30h；得到高密度发酵菌液；(d)、喷雾干燥：在高密度发酵菌液中加入2～10％w/v的保护剂，搅拌均匀后进行干燥；喷雾干燥条件为：进风口温度150～180℃，出风口温度70～90℃，进料速度1～3L/h；收集得到枯草芽孢杆菌干粉制剂。2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵及喷雾干燥方法，其特征在于，步骤(c)中，自初始状态到发酵罐内活菌数达到稳定状态的发酵阶段，发酵罐内的温度控制在34～37℃；发酵罐内的活菌数达到稳定状态至放罐阶段，发酵罐内的温度控制在30℃～34℃。3.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵及喷雾干燥方法，其特征在于，步骤(d)中，所述保护剂选自玉米淀粉...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦为辉，杨帆，吴泽强，严星，杨中正，付爱思，丁琼，熊峰，
申请(专利权)人：武汉光谷创赢生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42