一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养基、发酵培养方法以及菌粉包埋方法技术

本发明专利技术提供了一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养基、发酵培养方法以及菌粉包埋方法；所述发酵培养基为：玉米浆干粉0.3‑1.5％，大豆蛋白胨0‑1.8％，低聚果糖0‑1％，葡萄糖0.5‑1％，磷酸氢二钾0.4‑1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015‑0.02％，L‑半胱氨酸盐酸盐0.05％；或者玉米浆干粉0.3‑1.5％，牛肉膏0‑1％，低聚果糖0‑1％，葡萄糖0.5‑1％，磷酸氢二钾0.4‑1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015‑0.02％，L‑半胱氨酸盐酸盐0.05％；所述发酵方法包括菌种活化培养、一级菌种培养、二级种子液制备、车间200L小罐培养和车间1T大罐发酵培养。本发明专利技术提供的培养基组方相对传统TPY培养基，活菌数提高10倍以上，成本降低60％，且该组方原料易于购买，成分简单，适合工业化生产需求。所述菌种包埋技术，大大提高菌种耐受人体及外界环境的能力。

Industrial high-density mixed fermentation medium for Bifidobacterium and Lactobacillus, fermentation culture method and embedding method of bacteria powder

The invention provides an industrialized high density mixed fermentation medium for bifidobacteria and Lactobacillus, a fermentation medium, a fermentation culture method, and a bacterial powder embedding method. The fermentation medium is: corn pulp dry powder 0.3, 1.5%, soybean peptone 0, 1.8%, fructooligosaccharide 0 1%, glucose 0.5 1%, two potassium phosphate 0.4, 0.4 Potassium dihydrogen phosphate 0.4%, Magnesium Sulfate 0.015 and 0.02%, L cysteine hydrochloride 0.05%, or corn pulp dry powder 0.3 1.5%, beef cream 0 1%, oligosaccharide 0 1%, 0.5 glucose 1%, potassium phosphate hydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate and cysteine hydrochloride 05%: the fermentation methods include the culture of bacteria activation, the first class strain culture, the preparation of two grade seed liquid, the 200L pot culture of the workshop and the 1T large pot fermentation in the workshop. The culture medium provided by the invention is more than 10 times more living bacteria than the traditional TPY medium, and the cost is reduced by 60%. The material is easy to buy, the composition is simple, and it is suitable for the industrial production demand. The bacteria embedding technology can greatly enhance the ability of bacteria to tolerate human body and external environment.

【技术实现步骤摘要】
一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养基、发酵培养方法以及菌粉包埋方法
本专利技术属于益生菌制品制备
，涉及一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养基、发酵培养方法以及菌粉包埋方法。
技术介绍
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效，从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性微生物的总称。人体肠道中栖息着数量巨大的微生物群，它们的构成和活动影响着宿主的免疫、黏膜的发育及营养与药物的代谢。乳酸菌作为益生菌的主要类别之一，在维持肠道菌群平衡、降低胆固醇、减少内毒素、促进人体正常生理功能等方面发挥重要作用，因此各种乳酸菌制品风靡全世界。人体肠道中栖息着数量巨大的微生物群，它们的构成和活动影响着宿主的免疫、黏膜的发育及营养与药物的代谢。目前可用于食品中的益生菌种类主要有：双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属、丙酸杆菌属、明串球菌属、片球菌属、芽孢杆菌属，其中双歧杆菌属及乳杆菌属为其中的主要种类，亦是人体中维护机体健康的正常菌群之一。由于工艺流程等差别，实验室成果不能反应生产的实际情况，实验室研究很难对大型工业设备中出现的许多问题作充分的考虑。在连续运转的工业生产上，如何保证设备的稳定、工艺的重现性、降低工艺成本、解决实验室中所不能解决和发现的问题，是工业化大生产中必然面对的问题。目前乳酸杆菌类常用的培养主要为MRS培养基，双歧杆菌类常用为TPY培养基，但这两种培养基成本较高，很多原料购买渠道窄，且活菌数相对较低，尤其是TPY培养基，为了降低成本提高活菌数，研究人员进行了一系列培养基优化，如添加具有双歧增长因子的物质，如番茄汁、菊芋汁、胡萝卜汁等，虽然达到了一定的提高活菌数的目的，但此类培养基配制步骤繁琐，促生长因子的价格因季节变化较大，成本较高，不适宜于工业化生产的需求。所以在生产制备菌体过程中，廉价经济的培养基显的格外重要。益生菌在生产、销售贮藏以及进入宿主的胃肠道的过程中，需经受一系列外在及人体不良环境因素的影响，致使定植于肠道的益生菌活菌数大大降低，从而限制了其生理作用的发挥。如何有效提高益生菌在生产、贮藏、销售以及在宿主消化道内逆环境的抵抗力，成为国内外研究的热点。其中筛选抗性菌株，添加保护剂和包埋都比较有效，然而研究最多的还是微胶囊包埋技术。微胶囊技术(microencapsulation)是一种利用天然或合成的高分子成膜材料把分散均匀的固体微粒、液体或气体包覆形成微小固体颗粒的技术，其中，被微胶囊包埋在内部的物质称为芯材，包埋芯材实现微囊胶化的物质称为壁材。利用微胶囊包埋技术，将芯材与外界不利环境隔离，使其免受不利环境的影响，进而保持芯材物质的稳定性。将益生菌包埋于微胶囊微球中，不仅可增强菌株对光线、温度、氧气等不良外界环境因素的抵抗能力，提高其在加工及贮藏中的稳定性，而且能显著提高益生菌在胃酸环境中的存活率，因此微胶囊包埋效果在益生菌领域的应用越来越受到人们的关注。微囊化可以保护益生菌免受不利环境因素的影响，但在食品加工中，所用的微囊化载体材料都要求是食品级以上。
技术实现思路
为解决目前益生菌共培养中培养基成本较高、工业化生产方法复杂及菌粉体外存活率低等问题，同时提高工业化生产中乳酸菌的活菌数，本专利技术提供了一种直投式双歧杆菌和乳酸杆菌的高密度混合发酵培养基、发酵培养方法和大生产发酵方法，通过筛选优化不同的培养基及培养方式，同时采取一些简单实用的代谢调控手段等综合措施，使培养液中乳酸菌的密度达到1010cfu/ml。本专利技术所涉及工业化生产组方相对传统TPY培养基，活菌数提高10倍以上，成本降低60％左右，而且该组方原料易于购买，成分简单，适合工业化生产的需求。同时本专利技术还提供了一种提高菌粉稳定性的菌种包埋技术，通过包埋之后的菌粉大大提高了其耐受人体环境及外界环境的存活能力。本专利技术的技术方案如下：一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养基，所述发酵培养基的成分及质量分数为：玉米浆干粉0.3-1.5％，大豆蛋白胨0-1.8％，低聚果糖0-1％，葡萄糖0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015-0.02％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％；或者玉米浆干粉0.3-1.5％，牛肉膏0-1％，低聚果糖0-1％，葡萄糖0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015-0.02％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％，将以上组分混合后加水溶解制得。本专利技术还提供了一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养方法，所述方法包括以下步骤：步骤一，菌种活化培养：分别将MRS及TPY斜面培养基pH值调节至6.5-7.0，在121℃下湿热灭菌15-30min后备用；在菌种活化前，将-80℃保存的装有乳酸杆菌、双歧杆菌的安瓿瓶分别在室温放置2-3h，然后在无菌操作台中用75％的酒精棉球擦拭安瓿瓶表面，打开安瓿瓶，用灭菌的接种环分别挑取2-3环，均匀划线，将乳酸杆菌接种于MRS斜面培养基、将双歧杆菌接种于TPY斜面培养基，分别在厌氧条件下于30-37℃培养24-48h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后连续活化2次；步骤二，一级菌种培养：在无菌操作台中采用接种环取步骤一制得的斜面活化2代后的乳酸杆菌菌种接种于200ml的MRS培养液中，取斜面活化2代后的双歧杆菌菌种接种于200ml的TPY培养液中，其中本操作中TPY培养液采用食用油油封2-3cm高度，将接种后的MRS培养液和TPY培养液分别在需氧条件下于30-37℃培养24-48h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用；步骤三，二级种子液制备：分别取步骤二制得的含乳酸杆菌的MRS培养液和含双歧杆菌的TPY培养液，乳酸菌培养液和双歧杆菌培养液按体积比1:1混合后，接种到二级种子培养基SQ1培养基中，乳酸菌培养液和双歧杆菌培养液混合液占二级种子培养基体积比为3-4％；二级种子液采用大豆油油封2-3cm高度，需氧条件下30-37℃培养18-24h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用；所述二级种子培养基SQ1培养基各成分及质量分数如下：玉米浆干粉0.3-1.5％，大豆蛋白胨0-1.8％，低聚果糖0-1％，葡萄糖0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015-0.02％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％，将以上组分混合后加水溶解制得；步骤四，车间200L小罐培养：取步骤三制得的二级种子液，按2-8％的体积比，接种到200L小罐培养基SQ1培养基中，氮气保压，维持压力0.05MP，于30-37℃培养12-16h，终止培养，得到小罐发酵液，期间每2h镜检菌体形态，无污染后转1T大罐。步骤五，车间1T大罐发酵培养：按2-3％的体积比，将步骤四制得的小罐发酵液转接SQ1培养基或者大罐培养基SQ2培养基中，氮气保压，维持压力0.05MP，30-37℃培养12-16h，每2h镜检菌体形态，于6h补料1-2％(与发酵液的重量比)葡萄糖和0.5-1％的玉米浆干粉(与发酵液的重量比)一次，发酵期间控制pH值稳定在6.0-6.5。发酵结束后分批将大罐发酵液转移到管式离心机中，于0～8℃转速8000～10000rpm离心2～2.5h本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的成分及质量分数为：玉米浆干粉0.3‑1.5％，大豆蛋白胨0‑1.8％，低聚果糖0‑1％，葡萄糖0.5‑1％，磷酸氢二钾0.4‑1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015‑0.02％，L‑半胱氨酸盐酸盐0.05％；或者玉米浆干粉0.3‑1.5％，牛肉膏0‑1％，低聚果糖0‑1％，葡萄糖0.5‑1％，磷酸氢二钾0.4‑1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015‑0.02％，L‑半胱氨酸盐酸盐0.05％，将以上组分混合后加水溶解制得。

【技术特征摘要】
1.一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的成分及质量分数为：玉米浆干粉0.3-1.5％，大豆蛋白胨0-1.8％，低聚果糖0-1％，葡萄糖0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015-0.02％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％；或者玉米浆干粉0.3-1.5％，牛肉膏0-1％，低聚果糖0-1％，葡萄糖0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015-0.02％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％，将以上组分混合后加水溶解制得。2.根据权利要求1所述的一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的成分及质量分数为：玉米浆干粉1％，大豆蛋白胨1.2％，低聚果糖0.2％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾0.4％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％；或者玉米浆干粉1.5％，牛肉膏0.6％，低聚果糖0.2％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾0.4％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％，将以上组分混合后加水溶解制得。3.一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤一，菌种活化培养：分别将MRS及TPY斜面培养基pH值调节至6.5-7.0，在121℃下湿热灭菌15-30min后备用；在菌种活化前，将-80℃保存的装有乳酸杆菌、双歧杆菌的安瓿瓶分别在室温放置2-3h，然后在无菌操作台中用75％的酒精棉球擦拭安瓿瓶表面，打开安瓿瓶，用灭菌的接种环分别挑取2-3环，均匀划线，将乳酸杆菌接种于MRS斜面培养基、将双歧杆菌接种于TPY斜面培养基，分别在厌氧条件下于30-37℃培养24-48h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后连续活化2次；步骤二，一级菌种培养：在无菌操作台中采用接种环取步骤一制得的斜面活化2代后的乳酸杆菌菌种接种于200ml的MRS培养液中，取斜面活化2代后的双歧杆菌菌种接种于200ml的TPY培养液中，其中本操作中TPY培养液采用食用油油封2-3cm高度，将接种后的MRS培养液和TPY培养液分别在需氧条件下于30-37℃培养24-48h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用；步骤三，二级种子液制备：分别取步骤二制得的含乳酸杆菌的MRS培养液和含双歧杆菌的TPY培养液，乳酸菌培养液和双歧杆菌培养液按体积比1:(1～2)混合后，接种到二级种子培养基SQ1培养基中，乳酸菌培养液和双歧杆菌培养液混合液占二级种子培养基体积比为3-4％；二级种子液采用大豆油油封2-3cm高度，需氧条件下30-37℃培养18-24h，终止培养，镜检菌体形态，无污染后备用；所述二级种子培养基SQ1培养基各成分及质量分数如下：玉米浆干粉0.3-1.5％，大豆蛋白胨0-1.8％，低聚果糖0-1％，葡萄糖0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015-0.02％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％，将以上组分混合后加水溶解制得；步骤四，车间200L小罐培养：取步骤三制得的二级种子液，按2-8％的体积比，接种到200L小罐培养基SQ1培养基中，氮气保压，维持压力0.05MP，于30-37℃培养12-16h，终止培养，得到小罐发酵液，期间每2h镜检菌体形态，无污染后转1T大罐；步骤五，车间1T大罐发酵培养：按2-3％的体积比，将步骤四制得的小罐发酵液转接到SQ1培养基或者大罐培养基SQ2培养基中，氮气保压，维持压力0.05MP，30-37℃培养12-16h，每2h镜检菌体形态，于6h补充发酵液重量1-2％的葡萄糖和0.5-1％的玉米浆干粉一次，发酵期间控制pH值稳定在6.0-6.5；发酵结束后分批将大罐发酵液转移到管式离心机中，设置离心机温度为0-8℃，转速8000-10000rpm离心2～2.5h，获取菌泥；所述1T大罐培养基SQ2培养基各成分及质量分数如下：玉米浆干粉0.3-1.5％，牛肉膏0-1％，低聚果糖0-1％，葡萄糖0.5-1％，磷酸氢二钾0.4-1.35％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.015-0.02％，L-半胱氨酸盐酸盐0.05％，将以上组分混合后加水溶解制得；补料成分为葡萄糖和玉米浆干粉。4.根据权利要求3所述的一种双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化高密度混合发酵培...

【专利技术属性】
技术研发人员：单宝龙，王静，任宝涛，李晓颖，张颜廷，刘虹，
申请(专利权)人：山东凤凰生物有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37