本发明专利技术属于皮肤光损伤修复的技术领域，本发明专利技术公开了人脐带间质干细胞分泌的exosome在制备修复皮肤紫外线损伤的药物中的应用。脐带间质干细胞exosome是一种天然囊泡，免疫原性较低。同时其在组织再生修复中具有类似亲代细胞的功能，如抗氧化、抗炎、促增殖和抑制细胞凋亡、促进胶原蛋白合成等，可以在多方面发挥皮肤保护作用。因此exosome也有望成为去细胞治疗的替代策略，在多种皮肤再生相关疾病中具有重要的临床应用前景及市场转化价值。
Application of exosome secreted from human umbilical cord mesenchymal stem cells in the preparation of drugs for repairing ultraviolet injury of skin
The invention belongs to the technical field of skin photodamage repair, and discloses the application of exosome secreted by human umbilical cord mesenchymal stem cells in the preparation of medicines for repairing skin ultraviolet damage. Umbilical cord mesenchymal stem cell exosome is a natural vesicle with low immunogenicity. At the same time, it has similar parental cell functions in tissue regeneration and repair, such as anti-oxidation, anti-inflammation, promoting proliferation and inhibiting cell apoptosis, promoting collagen synthesis and so on, can play a protective role in many aspects of the skin. Therefore, exosome is expected to become an alternative strategy for acellular therapy, and has important clinical application prospects and market value in a variety of skin regeneration-related diseases.
【技术实现步骤摘要】
人脐带间质干细胞分泌的exosome在制备修复皮肤紫外线损伤的药物中的应用
本专利技术属于皮肤光损伤修复的
，更具体的，本专利技术涉及一种脐带间质干细胞分泌的直径为100nm左右的囊泡结构外泌体(exosome)在促进皮肤光损伤修复中的药用作用。
技术介绍
随着臭氧层的破坏，其所吸收紫外线的能力降低，人们接受过量的紫外线辐射的机会也大大的增加。过量的紫外线辐射可导致皮肤出现光晒伤及光老化，同时也使皮肤癌的发病率大大增加。不仅影响容貌，而且也危及患者生命。据不完全统计，全世界主要范围内，每年都会有大约10万人死于皮肤癌，大多数的病例都与接触过量的紫外线辐射十分有关。由于臭氧层当中的臭氧每损耗1％，导致皮肤癌的发病率就会快速增加到2％。另外，由于过量的紫外线辐射还会诱发各种眼科疾病，如白内障、角膜肿瘤等。传统的药物及化妆品治疗：存在见效慢、疗效差等缺点；外科治疗、注射性治疗及剥脱性治疗：有一定创伤，皮肤恢复缓慢、术后并发症多；非剥脱性激光及射频技术：容易造成炎症后色素沉着、瘢痕等并发症，且波长单一、适用范围小。脐带MSC来源exosome在多种组织损伤中均具有显著促修复作用。在小动物皮肤缺损和烫伤模型中，我们的研究表明人脐带MSC来源exosome能够有效的促进损伤后皮肤再生。现有促进皮肤损伤的方法，主要有清创、抗感染和应用生长因子等方式，但对于大面积或者慢性难愈合性溃疡等损伤，多存在作用方式单一、治疗效果不佳等问题。目前基于干细胞在再生医学中的研究广泛，部分干细胞制剂已经转化为临床应用。而作为脐带间质干细胞发挥旁分泌作用的主要成分exosome，因为容易分离获取、易于保存和运输、使用剂量易于控制、长期应用无致瘤风险等优势，具有广阔的应用前景。期望通过单独或联合方式应用exosome于皮肤再生医学，逐步推动其临床应用，或与皮肤美容相关行业交叉，将其开发成新型皮肤保护产品。微囊泡结构exosome是细胞间信号通讯的重要生物活性分子，主要特性有：(1)直径为40-100nm；(2)杯或球形结构；(3)含有脂质双分子层，密度为1.13-1.19g/ml；(4)表面标记有：CD9、CD81、CD63等。Exosome内涵多种蛋白质、核酸及脂质等：包括非编码RNA，增殖代谢相关蛋白等，其组成较为复杂，因此功能也较为多样。目前市场上用于紫外线防治的多数防晒物，多数添加了抗氧化和保湿成分，不仅修复作用局限，而且过敏反应较多。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术首次提出了人脐带间质干细胞来源的exosome在修复皮肤光损伤中的药用价值。本专利技术公开了人脐带间质干细胞分泌的exosome在制备修复皮肤紫外线损伤的药物中的应用。本专利技术提及的exosome是由脐带间质干细胞分泌，目前exosome分离方法较多，如差速超速离心联合蔗糖重水沉淀法、免疫磁珠分离法、超速离心法、高效液相色谱法以及试剂盒法，可以根据样本量大小和纯度要求选择合适的分离提纯方法。一种具体的分离提纯方法，步骤如下：(1)脐带间质干细胞的原代培养：依据本课题组已经建立的脐带来源间质干细胞的方法进行分离培养,并进行多向分化和流式指标的鉴定(QiaoChunetal.Humanmesenchymalstemcellsisolatedfromtheumbilicalcord.CellBiolInt.2008Jan；32(1):8-15.)(2)将原代分离的脐带间质干细胞培养至P3代开始加入无血清低糖DMEM进行培养上清的收集，收集时间为48h，收集上清的细胞密度在70％以上，原代细胞培养至P6代后停止上清收集；(3)将收集培养上清将收集的hucMSC上清液于4℃、2000×g离心20min，以去除细胞碎片；收集上清后于4℃、10000×g离心30min，以去除细胞器；将上清转移至100-kDaMWCO超滤离心管，4℃、1000×g离心30min进行浓缩；将浓缩液缓慢移至5ml30％蔗糖/重水密度垫(ρ＝1.210g/cm3)，4℃、100000×g离心2h；收集底部5ml蔗糖/重水层(含exosome)，用PBS稀释后加入100-kDaMWCO超滤离心管中，4℃、1000×g离心30min，PBS洗涤3次；最后用0.22μm滤器过滤除菌，得到exosome分装后于－80℃冰箱保存，并用BCA蛋白质定量试剂盒法进行蛋白质定量检测。由上述提取方法不难发现，本专利技术涉及的脐带间质干细胞来源的exosome用于修复皮肤光损伤的药用作用在分泌提取后与脐带间质干细胞无关，无任何细胞成分，因此，便于运输和储存；本专利技术说明的脐带间质干细胞来源的exosome具有进行皮肤光损伤修复的药用价值；在一具体实例中，本专利技术涉及的脐带间质干细胞来源的exosome可以缓解紫外线所致的皮肤损伤；在一具体实例中，脐带间质干细胞来源的exosome也可促进皮肤再生，并减少胶原流失。本专利技术的有益效果体现在：脐带间质干细胞exosome是一种天然囊泡，免疫原性较低。同时其在组织再生修复中具有类似亲代细胞的功能，如抗氧化、抗炎、促增殖和抑制细胞凋亡、促进胶原蛋白合成等，可以在多方面发挥皮肤保护作用。因此exosome也有望成为去细胞治疗的替代策略，在多种皮肤再生相关疾病中具有重要的临床应用前景及市场转化价值。本专利技术无需进一步的阐述，相信本专利
的技术人员能够基于前面所述内容即可利用本专利技术做合理的扩展。因此，可以认为以下实例的阐述仅仅是作为实例进行说明而已，而非以任何方式限制脐带间质干细胞的exosome在皮肤光损伤中的药用作用。附图说明图1为脐带间质干细胞上清中提取exosome方法的示意图。图2为nanosight检测脐带间质干细胞来源exosome的颗粒直径及浓度。图3为WesternBlot方法检测exosome的蛋白标记CD63和CD9的表达情况。图4为脐带间质干细胞来源exosome对SD大鼠皮肤紫外线损伤修复3d的大体照片和HE染色后显微镜拍摄的照片(100倍)。图5为天狼猩红染色检测紫外线损伤对真皮层细胞外基质的影响。图6为脐带间质干细胞来源exosome对SD大鼠皮肤紫外线损伤修复6d的大体照片和HE染色后显微镜拍摄的照片(100倍)。图7为Masson三色染色检测紫外线损伤对真皮层细胞外基质的影响。具体实施方式以下结合附图和实例详细说明本专利技术。实施例1，脐带间质干细胞分泌exosome的分离纯化；实例1所使用的主要材料和来源分别如下：MSC培养试剂低糖DMEM、胎牛血清(Gibco公司产品)、胰蛋白酶(Sigma公司产品)、二氧化碳培养箱(Forma公司)、无血清培养基(上海依科赛公司)倒置显微镜，生物显微镜，超净工作台，台式离心机；exosome提取试剂EXOTC10A-1(SBI公司)，兔抗人CD9抗体(美国BioworldTechnology公司)，兔抗人CD63抗体(美国Abcam公司)，BCA蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(北京康为世纪公司)，预混HRP化学发光底物、100-kDaMWCO超滤离心管、0.22μm无菌滤膜(美国Millipore公司)；抗人CD9抗体和兔抗人CD63抗体(Abcam公司)；如附图1中，对本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.人脐带间质干细胞分泌的exosome在制备修复皮肤紫外线损伤的药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.人脐带间质干细胞分泌的exosome...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴佩佩，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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