一种从人脐带血血清中分离制备抗氧化活性成分的方法技术

本发明专利技术提供了一种从人脐带血血清中分离出具有抗氧化功效的活性成分的方法，并对其具体应用进行了描述。按照下述步骤进行该活性成分的制备：正常剖宫产手术或顺产过程中，无菌条件下取脐带血，取脐带血过程中不加抗凝剂；将脐带血注入到无菌玻璃瓶中，静置待血液凝固后，离心搜集上清液储存备用，同时留取2～3mL血清于进行微生物检验。经检验合格的血清稀释后，采用不同规格的超滤管进行离心超滤，最终获得分子量小于10KD的具有抗氧化功效的分离物。此部分分离物可冻干制成冻干粉末，以方便存储使用。本发明专利技术提供的人脐带血血清分离物具有良好的抗氧化活性，能够帮助细胞抵抗自由基的侵害，分离物来自于人体自身组织，安全性高，有望应用于药品、保健品、护肤品及其他日用化工品等产品中。本发明专利技术所提供的分离方法简单易行，成本低廉，适合工业化生产。

A method of isolation and preparation of antioxidant active components from human umbilical cord blood serum

The present invention provides a method for separating active components from the blood serum of human umbilical cord, and describes its specific application. The active components in accordance with the following steps: preparing the normal cesarean section or vaginal delivery process, under aseptic conditions, umbilical cord blood, umbilical cord blood without anticoagulant process; umbilical cord blood was injected into the sterile glass bottle, standing for blood coagulation, collect the supernatant centrifugal storage reserve, and collected 2 in the microbial test to 3mL serum. The serum dilution test qualified, with different specifications of the ultrafiltration centrifugal ultrafiltration, finally obtained antioxidant effect isolates the molecular weight less than 10KD. This part of the separation can be freeze-dried to make the freeze-dried powder so that it can be easily stored and used. Human umbilical cord blood serum isolates provided by the invention has good antioxidant activity, can help cells against free radicals, isolates from the body's own tissues, high safety, is expected to be used in medicine, health care products, skin care products and other daily chemicals and other products. The separation method provided by the invention is simple and easy to operate, and has low cost and is suitable for industrial production.

【技术实现步骤摘要】
一种从人脐带血血清中分离制备抗氧化活性成分的方法
本专利技术涉及一种从人脐带血血清中分离制备一种具有抗氧化活性成分的方法（分子量为10KDa以下），属于细胞及生物工程领域。
技术介绍
抗氧化物质是一类能帮助捕获并中和自由基，从而祛除自由基对人体损害的一类物质。人体的抗氧化剂可来自于自身合成，也可由食物供给。科学研究表明，癌症、衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生有关联。研究抗氧化可以有效克服其所带来的危害，所以抗氧化被药品、保健品、护肤品生产企业及其他日用化工生产企业列为研发方向之一，也是市场最重要的功能性诉求之一。由于传统采用化学工艺合成的抗氧化剂如BHA、BHT等具有毒副作用，因而其在产品中的添加量被各国严格控制。来自于动植物组织中的天然的抗氧化剂将有效解决化学合成抗氧化剂的毒副作用问题。脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在脐带中的血液，通常是废弃不用的。近十几年的研究发现，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗多种疾病。因此，脐带血已成为造血干细胞的重要来源。脐带血具有多种优点，其未受到放射、药物、毒物、病菌或其他污染；容易采集、不具备伤害性、不会对产妇及新生儿产生不良影响且来源丰富。脐带血血清是脐带血干细胞生长、发挥生理作用的重要组成部分，内含多种细胞因子和营养因子，已有研究表明，脐血血清中含有能够促进刺激细胞生长、延缓表皮细胞衰老的表皮生长因子（EGF）；最新研究表明其含有能够治疗炎症和败血症的名为新生儿NET抑制因子(nNIF)的特殊多肽；此外还含有维生素E、过氧化物酶等抗氧化，保护细胞免受自由基侵害的物质。本专利技术从脐带血血清中提取出具有抗氧化活性的有效成分，该成分来源于人体组织，安全性高，抗氧化性能好，有望应用于药品、保健品及护肤品中。
技术实现思路
本专利技术仅采用离心超滤的方法对人脐带血血清成分进行分离，并对各不同级分中所含有的有效成分进行了研究，结果发现，脐带血血清的低分子量级分（分子量为10KDa以下）具有优异的抗氧化功能，它能有效清除DPPH自由基，羟基自由基及超氧阴离子自由基，同时所含有的丰富的物质还具有营养细胞的功效。该方法分离方式简单，分离成本低廉，分离物有望应用于药品、保健品、护肤品等日用化工品中，制备成多种形式的产品。本专利技术提供的一种具有抗氧化活性的脐带血血清分离物，制备步骤如下。步骤一：脐带血血清的制备：正常剖宫产手术或顺产过程中，无菌条件下取脐带血，取脐带血过程中不加抗凝剂。将脐血注入到无菌玻璃瓶中，1℃～5℃静置4～8小时，待血液凝固后，于1℃～5℃，1000g～3000g离心力的条件下离心，搜集上清液，继续离心，重复2～4次，搜集上清液储存备用，同时留取2～3mL血清于37℃，5%二氧化碳培养箱中培养3天，进行微生物检测。无菌生长的合格血清方可进行步骤二。步骤二：将滤液稀释后采用不同规格的超滤管进行离心超滤，于1℃～5℃，2000g～5000g的条件下超滤收集各不同级分进行抗氧化实验，评估各不同级分的抗氧化效果，最终获得具有抗氧化功效的分子量小于10KDa的分离物。将具有抗氧化功效的成分进行分装，冻干备用。步骤三：分离物抗氧化活性的测定。（1）清除DPPH自由基能力的测定。取分离物冻干粉配制成不同浓度的样品溶液，测定分离物对DPPH自由基的清除能力。具体步骤为：向离心管中分别加入2mL不同浓度梯度的样品溶液，再分别加入2mLDPPH溶液（95%乙醇配制，0.1mmol/L），混合均匀后避光反应30分钟。在517nm处测定吸光值A。上述步骤不加入DPPH，向每个试管中加入2mL95%乙醇，其余步骤不变测得数据A1。向离心管中加入2mL纯化水和2mLDPPH溶液，其余步骤不变，测得吸光值A0。以纯化水为空白，每个样品做3个平行试验，取平均值，计算公式如下：DPPH自由基清除率=[1-(A-A1)/A0]×100%。（2）羟基自由基清除能力的测定。取分离物冻干粉配制成不同浓度的样品溶液，测定分离物对羟基自由基的清除能力。实验步骤如下：在10mL的离心管中分别加入0.5mL配好的邻二氮菲溶液，1mL磷酸缓冲液，0.5mL不同浓度的样品溶液，加入0.5mL0.75mmol/LFeSO4溶液，混匀后再加入H2O2溶液0.5mL，在536nm处测定吸光度Ax；将上述步骤中样品溶液换为蒸馏水，其余不变，测定吸光度Af；将上述步骤中H2O2溶液换为蒸馏水，其余步骤不变测定吸光度A0；不加入H2O2，其余步骤不变，测定吸光度As。以纯化水为空白，每个样品做3个平行试验，取平均值，计算公式如下：羟基自由基清除率=（As-Ax）/(A0-Af)×100%。（3）超氧阴离子自由基清除能力的测定。采用邻苯三酚自氧化法。取分离物冻干粉配制成不同浓度的样品溶液，取0.1mL样品溶液加入2.8mL的0.1mol/LpH8.2的Tris-Hcl缓冲溶液，以0.1mL纯化水代替样品溶液作为空白对照。震荡混匀混合溶液，在25℃水浴保温10分钟后加入0.1mL3mmol/L的事先在25℃水浴锅中预热的邻苯三酚溶液，迅速混匀并开始计时，在325nm处测定A，每隔30s读取A325，4.5分钟后结束，以空白对照调零。做吸光度随时间变化的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V，按照下式计算计算样品对超氧阴离子的抑制率：抑制率（%）=（V对照-V样品）/V对照×100。优选的，步骤一中离心获取脐血血清的条件为：室温下1500g～2500g。优选的，离心过程需重复2～3次。优选的，步骤一中脐带血储存条件为：2℃～4℃，储存时间不超过3天。优选的，步骤二中，所使用的离心超滤管规格为：AmiconUltra-15的UFC901096超滤离心管；超滤离心条件为：1℃～4℃，2500g～3500g的条件下超滤。本专利技术所提供的一种具有抗氧化功效的，来自于脐带血血清的分子量小于10KDa的分离物的制备方法，各步骤对于温度的控制均在1℃～5℃，此温度下可以有效保持物质的活性；采用超滤的方式分离有效成分，分离方式简单，易于操作，成本低廉。本专利技术提供的一种来源于脐血血清的分离物，具有优良的抗氧化功效，其可在添加适当的辅料之后，采取适当措施，制备成可供食用的形态，例如片剂、胶囊、颗粒、糊剂等形态以方便食用；可与其他成分复配制成具有抗氧化功效的护肤品及其他日用化工品，如护肤水、护肤霜、沐浴露、护肤乳、润滑剂等。附图说明图1为分离物清除DPPH自由基能力的测定结果。图2为分离物清除羟基自由基能力的测定结果。图3为分离物清除超氧阴离子自由基清除的测定结果。具体实施方式下面结合具体的实施方式对本专利技术作进一步的说明，以更好的理解本专利技术。实施例1。步骤一：脐血血清的制备：正常剖宫产手术或顺产过程中，无菌条件下取脐带血，取脐血过程中不加抗凝剂。将脐血注入到无菌玻璃瓶中，4℃条件下静置6小时，待血液凝固后，于4℃，2000g离心力的条件下离心，搜集上清液，继续离心，重复2次。搜集上清液储存备用。同时留取2mL血清于37℃，5%二氧化碳培养箱中培养3天，进行微生物检测。无菌生长的合格血清方可进行步骤二。步骤二：将滤液稀释后采用不同规格的超滤管进行离心超率，于4℃，3000g的条件下超滤收集分子量小于10本文档来自技高网...

【技术保护点】
从人脐带血血清中分离制备具有抗氧化功效的活性成分，其方法包括以下步骤：步骤一，脐带血血清的制备：正常剖宫产手术或顺产过程中，无菌条件下取脐带血，取脐带血过程中不加抗凝剂；将脐带血注入到无菌玻璃瓶中，静置待血液凝固后，离心搜集上清液储存备用；同时留取2～3mL血清进行微生物检验，无菌生长的合格血清方可进行步骤二；步骤二：将血清稀释后采用不同规格的超滤离心管进行离心超率，最终获得具有抗氧化功效的分子量小于10KDa的分离物。

【技术特征摘要】
1.从人脐带血血清中分离制备具有抗氧化功效的活性成分，其方法包括以下步骤：步骤一，脐带血血清的制备：正常剖宫产手术或顺产过程中，无菌条件下取脐带血，取脐带血过程中不加抗凝剂；将脐带血注入到无菌玻璃瓶中，静置待血液凝固后，离心搜集上清液储存备用；同时留取2～3mL血清进行微生物检验，无菌生长的合格血清方可进行步骤二；步骤二：将血清稀释后采用不同规格的超滤离心管进行离心超率，最终获得具有抗氧化功效的分子量小于10KDa的分离物。2.根据权利要求1所述的从人脐带血血清中分离制备具有抗氧化功...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓勇，邵辰，朱成荣，
申请(专利权)人：武汉北度生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42