一种免疫抑制细胞制剂及其制备方法和应用技术

本申请属于生物医药技术领域，具体涉及一种免疫抑制细胞制剂及其制备方法和应用。本申请提供了一种免疫抑制细胞制剂，包括：Treg细胞、脐带间充质干细胞外泌体、脐血单个核细胞、脐血浆和医学上可接受的溶剂，以及所述免疫抑制细胞制剂在制备预防和治疗系统性红斑狼疮药物中的应用。本申请还提供了所述免疫抑制细胞制剂的制备方法。本申请的有益效果在于Treg细胞和脐带间充质干细胞外泌体先发挥抑制机体免疫亢进、平衡机体免疫系统功能，脐血单个核细胞再发挥免疫调控作用，改善血液环境，从根本上解决免疫系统紊乱的问题。

An immunosuppressive cell preparation and its preparation and Application

The application belongs to the field of biological medicine technology, and specifically relates to an immunosuppressive cell preparation, the preparation method and the application of the immunosuppressive agent. The invention provides a preparation of immunosuppressive cells, including Treg cells, umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes, cord blood mononuclear cells and human umbilical cord plasma and pharmaceutically acceptable solvents, and the use of immunosuppressive cell preparations in the prevention and treatment of systemic lupus erythematosus. The present application also provides a preparation method of the immunosuppressive cell preparation. The beneficial effect of the application in Treg cells and human umbilical cord mesenchymal stem cells to inhibit the exosome immune hyperfunction and balance function of the immune system, umbilical cord blood mononuclear cells and play immune regulation, improve blood environment, fundamentally solve the problem of immune system disorders.

【技术实现步骤摘要】
一种免疫抑制细胞制剂及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种免疫抑制细胞制剂及其制备方法和应用。
技术介绍
系统性红斑狼疮(SystemicLupusErythematosus，SLE)是一种弥漫性、全身性自身免疫病。在环境因素、雌激素水平等各种因素相互作用下，导致T淋巴细胞减少、T抑制细胞功能降低、B细胞过度增生，产生大量的自身抗体，并与体内相应的自身抗原结合形成相应的免疫复合物，沉积在皮肤、关节、小血管、肾小球等部位。在补体的参与下，引起急慢性炎症及组织坏死(如狼疮肾炎)，或抗体直接与组织细胞抗原作用，引起细胞破坏(如红细胞、淋巴细胞及血小板壁的特异性抗原与相应的自身抗体结合，分别引起溶血性贫血、淋巴细胞减少症和血小板减少症)。SLE可累及机体多个系统，包括关节、肌肉、肾脏、神经系统、血液系统、心脏和消化系统等，给患者多个组织脏器带来病理损害。SLE的治疗强调早期诊断和早期治疗，以避免或延缓组织的病理损害。现有治疗药物主要包括非甾体抗炎药、抗疟药、糖皮质激素和免疫抑制剂，其中非甾体抗炎药、抗疟药和糖皮质激素主要用于症状轻微，无明显内脏损害的患者症状改善治疗，以阻止或减少免疫细胞对内脏的损伤；免疫抑制剂如环磷酰胺、硫唑嘌呤等是治疗SLE的有效药物之一，能有效的诱导疾病缓解，阻止和逆转病变发展，改善远期预后，其缺陷主要在于长期使用，会使机体免疫功能受到抑制，不能从根本上治疗机体免疫系统紊乱和病情反复。Treg是一类调节性T细胞，对机体免疫起着抑制作用，能抑制对自身或外源抗原有害的的免疫反应。Treg细胞对于多种免疫失调疾病均具有治疗效果，在移植抗宿主反应和自身免疫疾病等动物模型中取得了显著效果，外周血来源的Treg细胞已经在欧洲多中心联合开展临床试验，但由于Treg细胞数量较少、扩增培养周期长，因此限制了其临床应用。近期研究显示脐带血来源的Treg细胞与外周血来源的Treg细胞一样具有免疫抑制作用，研究文献(马小倩等，2016年)提供了体外扩增脐血来源Treg细胞的分离纯化和扩增培养方法，使用该方法获得的Treg细胞数量和效力均能满足临床需求，为临床应用提供了可能。本专利技术即提供了一种含Treg细胞的免疫抑制制剂，及其在制备预防和治疗自身免疫性疾病系统性红斑狼疮药物中的应用。
技术实现思路
为了解决现有技术中系统性红斑狼疮治疗药物药效不足、副作用多这一技术问题，本专利技术实施例提供一种预防和治疗系统性红斑狼疮的免疫抑制细胞制剂及其制备方法。本专利技术的具体技术方案如下：一种免疫抑制细胞制剂，包括：Treg细胞、脐带间充质干细胞外泌体、脐血单个核细胞、脐血浆和医学上可接受的溶剂；所述Treg细胞的浓度为1×106～5×106个/mL；所述外泌体的浓度为每毫升细胞制剂中含有5×107～1×108个脐带间充质干细胞中所提取出来的外泌体总量；所述脐血单个核细胞的浓度为1×106～5×106个/mL；所述脐血浆的浓度为体积比5％。优选地，所述Treg细胞为来源于脐带血的Treg细胞。优选地，所述脐带间充质干细胞外泌体由脐带间充质干细胞经传代培养2～5代后提取得到。优选地，所述医学上可接受的溶剂包括生理盐水或5％葡萄糖注射溶液。优选的，所述免疫抑制细胞制剂的制备方法为：将所述脐血浆和所述溶剂混合，加入Treg细胞、脐血单个核细胞和脐带间充质干细胞外泌体，混匀后置于4℃环境中保存。本专利技术还提供了上述免疫抑制细胞制剂在制备预防或治疗系统性红斑狼疮药物中的应用。本专利技术的技术方案的有益效果在于：(1)本专利技术使用脐带血Treg细胞在会输后可立即发挥免疫抑制的功能，脐带干细胞外泌体能协同改善血液环境，强化Treg细胞的功能，血细胞类型会随着Treg细胞的回输而发生变化，各类型细胞因子的含量随之改变，从而起到级联调控的作用，抑制机体免疫亢进，起到立竿见影的效果。(2)依赖于Treg细胞和脐带干细胞外泌体的免疫调控作用，能够进一步改善患者血液环境，从而更有利于脐血单个核细胞的分化，通过初期的免疫抑制和后期的免疫调控，从而持续性的改善自身免疫性疾病的免疫环境，从根本上解决机体免疫系统紊乱的问题；(3)本专利技术开创性的采用了干细胞外泌体和脐血浆代替人血白蛋白，该方法能够保证细胞活率。具体实施方式为了解决现有技术中系统性红斑狼疮治疗药物药效不足、副作用多这一技术问题，本专利技术实施例提供了一种应用于预防或治疗系统性红斑狼疮的免疫抑制细胞制剂及其制备方法。下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例11.脐带间充质干细胞外泌体的制备(1)脐带干细胞原代培养步骤1：取脐带，于超净台中进行无菌清洗，剥离脐带羊膜和动静脉，取出沃顿胶，用手术剪进行剪碎；步骤2：用完全培养基(DMEM+10％FBS)重悬后接种至15cm平皿中，转移至37℃条件下，含5％CO2的培养箱中培养；步骤3：于5天后补液，直至细胞爬出，弃去组织块，补充新的完全培养基继续培养，待细胞形成较大的克隆，即可传代；(2)脐带干细胞的传代培养及鉴定步骤4：取可传代的原代细胞，弃掉皿内原培养液，加入10mLPBS缓冲液轻轻冲洗细胞生长面，弃去洗液，；步骤5：加入2mL0.25％胰蛋白酶，左右摇晃平皿使胰酶均匀覆盖于皿底，显微镜下观察可见细胞间隙增大，胞质回缩，当长梭形细胞变圆变亮时，立即加入10倍体积的完全培养基终止消化，用移液枪反复吹打贴壁细胞，直至细胞全部脱落成单细胞悬液，将悬液转移至离心管中，1500rpm离心5min，弃上清；步骤6：用完全培养基重悬细胞，按1×105cells/皿进行传代培养，重复传代培养；步骤7：取P2代细胞1×105cells，用于流式检测脐带干细胞的纯度，检测指标为细胞CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD19、CD11b及HLA-DR表达。(3)外泌体的分离步骤8：收集P2～P5代的脐带血干细胞，按照Invitrogen外泌体提取试剂盒(购自ThermoFisherScientific公司)说明书提取脐带干细胞外泌体，将提取的外泌体用500μL预冷的PBS缓冲液重悬，即得到所述的脐带间充质干细胞外泌体；步骤9：调整外泌体的浓度为每毫升细胞制剂中含有5×107～1×108个脐带间充质干细胞中所提取出来的外泌体总量，将外泌体置于-20℃保存。脐带间充质干细胞的表面抗原检测结果如表1所示，结果显示本实施例分离培养得到的脐带间充质干细胞高表达CD73、CD90、CD105，表达率分别为99.9％、99.9％、97.2％；低表达CD11b、CD19、CD34、HLA-DR和CD45,表达率分别为0.4％、0.1％、0.2％、0.1％、0.0％。符合间充质干细胞的表面抗原特征，说明了脐带间充质干细胞并没有出现分化的现象，仍维持着干细胞的特点。表1抗原类型CD73CD90CD105CD11bCD19CD34CD45HLA-DR表达率99.9％99.9％97.2％0.4％0.1％0.2％0.0％0.1％2.脐血单个核细胞的制备(1)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫抑制细胞制剂，包括：Treg细胞、脐带间充质干细胞外泌体、脐血单个核细胞、脐血浆和医学上可接受的溶剂；所述Treg细胞的浓度为1×10

【技术特征摘要】
1.一种免疫抑制细胞制剂，包括：Treg细胞、脐带间充质干细胞外泌体、脐血单个核细胞、脐血浆和医学上可接受的溶剂；所述Treg细胞的浓度为1×106～5×106个/mL；所述外泌体的浓度为每毫升细胞制剂中含有5×107～1×108个脐带间充质干细胞中所提取出来的外泌体总量；所述脐血单个核细胞的浓度为1×106～5×106个/mL；所述脐血浆的浓度为体积比5％。2.根据权利要求1所述的免疫抑制细胞制剂，其特征在于，所述Treg细胞为来源于脐带血的Treg细胞。3.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：马颖，郑皓钧，
申请(专利权)人：广东颜值科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44