环境或生物样本中的核酸纯化制造技术

本发明专利技术提供用于从包含核酸分析干扰物的环境或生物样本中，特别是从含微生物的样本中分离核酸的组合物和方法。

Nucleic acid purification in environmental or biological samples

The present invention provides a composition and method for separating nucleic acids from an environment or biological sample containing nucleic acid analysis interferon, in particular from a microorganism containing sample.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】环境或生物样本中的核酸纯化
本教导内容一般性涉及用于核酸纯化的组合物、方法和试剂盒，以用于来自环境或生物样本，特别是含有微生物样本的检测、定量和/或分析。引言含有微生物菌群的环境样本可能会对核酸的分析提出挑战，其主要是由于化合物的存在会干扰后来诸如聚合酶链反应(PCR或qPCR)或逆转录酶PCR(RTPCR)等分析技术。腐殖质是与核酸共纯化的PCR干扰物的一个实例，并且在环境样本中，特别是在土壤样本中含量丰富。Braid等人(JofMicrobiologicalMethods52(2003)389-393)使用絮凝剂、氯化镁、氯化铁、氯化钙和硫酸铝铵的每一种的溶液从环境DNA中去除土基抑制剂，并且据报道，硫酸铝铵显著降低了PCR抑制剂的共纯化，同时DNA产量损失最小。人体中有100万亿个细菌、病毒、真菌和微生物群落的其他成员，它们对我们的健康起着至关重要的作用。胃肠道、皮肤、口腔或泌尿生殖区的健康微生物组成与人类疾病诸如炎症性肠病、肥胖症、癌症、哮喘、糖尿病和过敏有关。尽管我们对微生物及其与宿主之相互作用的认识还处于初始阶段，但日益清晰的是，我们需要将其看作一个在人体内以稳态形式存在的复杂系统，与循环系统或免疫系统十分相像。因此，高度需要高效和实际的基础研究工具及试剂，以确保微生物群落的组成的精确表征、研究微生物群落内相互依赖的功能，并允许操作微生物群落内以及微生物群落与其宿主之间的相互作用。迫切需要下一代工具，例如用于微生物核酸的分离、用于测序和用于数据分析的改进的试剂盒。目前市场上现有的用于从环境样本和生物样本中分离DNA的试剂盒包括MOBIODNA分离试剂盒和PowerFecalTMDNA分离试剂盒(MOBIOLaboratories,Inc.，Carlsbad，CA)。每种试剂盒的说明手册指出，所述试剂盒的规定用途是使用InhibitorRemoval方法(IRT)去除样本中的非DNA物质，所述方法包括由离心法中断的两个单独的抑制剂去除步骤。IRT的引用据信与美国第7,459,548号专利有关，所述专利于2008年12月2日授予Brolaski等人，并提出一种在抑制性物质去除的关键阶段使用絮凝作用的方法。在第一步中，样本尤其与洗涤剂和第一絮凝剂(乙酸铵)接触，并且在第二步中在使核酸与第二絮凝剂(十二水合硫酸铝铵)接触之前将沉淀物与所述核酸分离。下文描述的实施例提供核酸制备方法和试剂，其允许简化且更有效地从含有微生物的样本中去除干扰物，使所得的纯化核酸在随后的分析中不会因那些干扰物的存在而受阻碍。专利技术概述如本文所用的“微生物”是指存在于环境或生物系统中的微生物的生态群落。环境样本或来自生物系统的样本可以包含，例如，源自动物、食物、植物或其组分、土壤、沉积物、污泥、堆肥、分解生物物质、活组织切片、组织学样本、体液或其拭子、毛发、皮肤样本或其拭子、排泄物样本或其拭子、考古遗物、泥炭沼泽、水过滤器或其拭子、陆地水、地下水、工业用水或其过滤器、粉尘过滤器或其拭子、运送培养基、营养培养基，或者空气过滤器或其拭子的样本。所述环境或生物样本可以包含土壤样本或排泄物(大便)样本。本文所提供的实验研究表明，在针对样本的细胞裂解物或细胞裂解物上清液执行的单一沉淀步骤中，可以很容易地去除存在于含有微生物的环境样本或含有微生物的生物样本中的核酸分析的干扰物。由此产生的干扰物耗尽上清液可以按照核酸分析方法直接测定或进行标准核酸纯化方案。如本文所用，术语“干扰物”是指可以干扰或破坏涉及DNA或RNA的反应或过程的任何化学或物理物质，并且包括对DNA或RNA操作具有不利影响的污染物或抑制剂。例如，干扰物的实例包括使用DNA或RNA作为底物的酶促反应的抑制剂和破坏DNA或RNA杂交的污染物。例如，干扰物可以是甲壳素、腐烂的植物材料、来自土壤的酶抑制剂、腐殖质(如腐植酸、腐植聚合物、胡敏素、腐植酸盐或黄腐酸)、来自堆肥的有机化合物、酚类、酚类聚合物或低聚物、光合色素、植物细胞壁、植物色素、多酚、多糖或单宁等。如本文所示的实施例是一种组合物，所述组合物包含乙酸铵及硫酸铝铵、十二水合硫酸铵、十二水合硫酸铝铵、硫酸铝钾、水合氯化铝、硫酸铝、氧化钙、氯化铁(III)、硫酸亚铁(II)、铝酸钠、硅酸钠或其组合。本文还显示的实施例是一种组合物，所述组合物包含乙酸铵和絮凝剂，其中所述絮凝剂为硫酸铝铵、十二水合硫酸铵、十二水合硫酸铝铵、硫酸铝钾、水合氯化铝、硫酸铝、氧化钙、氯化铁(III)、硫酸亚铁(II)、铝酸钠、硅酸钠或其组合。在一个实施例中，所述组合物包含乙酸铵和絮凝剂，其中所述絮凝剂为硫酸铝铵或十二水合硫酸铝铵。在又一实施例中，所述组合物包含乙酸铵、絮凝剂，及细胞裂解物、其体积部分、其上清液或其上清液的体积部分。所述组合物的储备溶液可以包含乙酸铵和絮凝剂，各自的浓度为5mM、10mM、50mM、100mM、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、1M、5M或10M或其间的任何整数或小数值或者其间的任何整数或小数范围。所述乙酸铵和所述絮凝剂每一种的浓度可以相同，也可以不同。在一个实施例中，所述组合物包含乙酸铵和十二水合硫酸铝铵的溶液，并且在又一实施例中，每种皆以基本等摩尔浓度存在。如本文所用，术语“基本等摩尔”是指以摩尔每升为单位测量，大约等于絮凝剂浓度±30％的乙酸铵浓度。另一个实施例是一种组合物，其由基本等摩尔浓度的乙酸铵和絮凝剂(如十二水合硫酸铝铵)的溶液组成。在上文所述组合物的一个实施例中，所述组合物包含5mM至300mM乙酸铵和5mM至300mM絮凝剂的溶液、5mM至200mM乙酸铵和5mM至200mM絮凝剂的溶液、25mM至200mM乙酸铵和25mM至200mM絮凝剂的溶液、50mM至150mM乙酸铵和50mM至150mM絮凝剂的溶液、50mM至130mM乙酸铵和50mM至130mM絮凝剂的溶液。在一个实例中，所述组合物包含基本等摩尔量的175mM乙酸铵和175mM絮凝剂的溶液、基本等摩尔量的150mM乙酸铵和150mM絮凝剂的溶液、基本等摩尔量的130mM乙酸铵和130mM絮凝剂的溶液。在一个实例中，所述组合物包含基本等摩尔量的65mM乙酸铵和65mM絮凝剂的溶液。在一个实例中，所述组合物包含基本等摩尔量的50mM乙酸铵和50mM絮凝剂的溶液。在又一实施例中，所述组合物包含作为固体成分的乙酸铵和絮凝剂的混合物，即作为例如片剂形式的粉末或盐。所述絮凝剂包含硫酸铝铵、十二水合硫酸铵、十二水合硫酸铝铵、硫酸铝钾、水合氯化铝、硫酸铝、氧化钙、氯化铁(III)、硫酸亚铁(II)、铝酸钠、硅酸钠或其组合。在一个实施例中，所述絮凝剂由硫酸铝铵、十二水合硫酸铵、十二水合硫酸铝铵、硫酸铝钾、水合氯化铝、硫酸铝、氧化钙、氯化铁(III)、硫酸亚铁(II)、铝酸钠、硅酸钠或其组合组成。在一个实施例中，所述絮凝剂是硫酸铝铵或十二水合硫酸铝铵。从包含所述核酸和至少一种核酸分析-干扰物的环境或生物样本中分离核酸的一种方法是本文提供的一个实施例。所述方法的一个实施例包括a)使用机械搅拌、酶促处理、化学处理、热处理或其组合破裂所述样本以产生裂解物；以及b)使所述裂解物、其体积部分、其上清液或其上清液的体积部分与如上所述的组合物接触，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，所述组合物包含乙酸铵及硫酸铝铵、十二水合硫酸铵、十二水合硫酸铝铵、硫酸铝钾、水合氯化铝、硫酸铝、氧化钙、氯化铁(III)、硫酸亚铁(II)、铝酸钠、硅酸钠或其组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.10 US 62/216,6761.一种组合物，所述组合物包含乙酸铵及硫酸铝铵、十二水合硫酸铵、十二水合硫酸铝铵、硫酸铝钾、水合氯化铝、硫酸铝、氧化钙、氯化铁(III)、硫酸亚铁(II)、铝酸钠、硅酸钠或其组合。2.根据权利要求1所述的组合物，进一步包含细胞裂解物、其体积部分、其上清液，或其上清液的体积部分。3.一种从环境或生物样本中分离核酸的方法，所述环境或生物样本包含所述核酸和至少一种核酸分析-干扰物，所述方法包括：a.使用机械搅拌、酶促处理、化学处理、热处理或其组合破裂所述样本以产生裂解物；以及b.使所述裂解物、其体积部分、其上清液或其上清液的体积部分与权利要求1所述的组合物接触，以形成含干扰物的沉淀物和含核酸的干扰物耗尽溶液；以及c.从所述含核酸的干扰物耗尽溶液中分离核酸以形成分离的核酸。4.根据权利要求3所述的方法，其中破裂所述样本包括在存在包含至少一种离液剂的裂解试剂的条件下的化学处理，其中所述裂解试剂不含乙酸铵、氯化钠、硫酸铵、乙酸钾或乙酸钠。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述组合物包含5mM至200mM乙酸铵和5mM至200mM絮凝剂的溶液。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述组合物包含50mM至130mM乙酸铵和50mM至130mM絮凝剂的溶液。7.根据权利要求3所述的方法，其中所述环境或生物样本包含源自动物、食物、植物或其组分、土壤、沉积物、污泥、堆肥、分解生物物质、活组织切片、组织学样本、体液或其拭子、毛发、皮肤样本或其拭子、排泄物样本或其拭子、考古遗物、泥炭沼泽、水过滤器或其拭子、陆地水、地下水、工业用水或其过滤器、粉尘过滤器或其拭子、运送培养基、营养培养基，或者空气过滤器或其拭子的样本。8.根据权利要求3所述的方法，其中所述核酸包含DNA，并且所述方法进一步包括使所述分离的DNA与利用DNA作为底物的酶接触，其中所述酶是聚合酶、连接酶、磷酸酶或其酶活性片段或突变体。9.根据权利要求3所述的方法，其中所述核酸包含DNA，并且所述方法进一步包括通过对所述DNA的至少一部分进行测序来表征所述分离的DNA。10.根据权利要求3所述的方法，其中所述环境或生物样本包含土壤样本或大便样本。11.根据权利要求4所述的方法，其中所述裂解试剂包含洗涤剂和/或磷酸盐缓冲剂。12.一种从环境或生物样本中去除DNA分析-干扰物以产生分离的DNA的方法，包括：a.在存在包含洗涤剂和至少一种离液剂的裂解试剂的条件下破裂所述样本以产生裂解物，其中所述裂解试剂不含乙酸铵、氯化钠、硫酸铵、乙酸钾或乙酸钠；以及b.使所述裂解物、其体积部分、其上清液或其上清液的体积部分与包含乙酸铵和絮凝剂的组合物接触，以形成含干扰物的沉淀物和含DNA的干扰物耗尽溶液；以及c.从所述含DNA的干扰物耗尽溶液中分离DNA以产生所述分离的DNA。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述絮凝剂包含硫酸铝铵、十二水合硫酸铵、十二水合硫酸铝铵、硫酸铝钾、水合氯化铝、硫酸铝、氧化钙、氯化铁(III)、硫酸亚铁(II)、铝酸钠、硅酸钠或其组合。14.根据权利要求12所述的方法，其中所述絮凝剂是十二水合硫酸铝铵并且所述组合物包含5mM到200mM乙酸铵和5mM到200mM十二水合硫酸铝铵的溶液。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述溶液包含基本等摩尔浓度的乙酸铵和十二水合硫酸铝铵。16.根据权利要求12所述的方法，其中所述破裂包括加热步骤。17.一种从裂解的环境或生物样本中耗尽DNA分析-干扰物的方法，所述改进包括：使含有DNA的所述裂解样本的上清液与包含乙酸铵和絮凝剂的组合物接触，以形成包含所述DNA分析-干扰物的沉淀物和包含DNA的干扰物耗尽溶液。18.一种用于从包含核酸的粗制样本制备物中耗尽测定抑制剂的方法，所述方法包括：使所述粗制样本制备物与包含乙酸铵和絮凝剂的溶液或混合物在其中所述测定抑制剂形成沉淀复合物的条件下接触；以及从所述粗制样本制备物中分离所述沉淀复合物以产生包含核酸的澄清制样本制备物。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述粗制样本制备物是由大便样本制得的上清液。20.根据权利要求3所述的方法，其中所述生物样本是大便样本，并且其中对所述分离的DNA进行病原生物的DNA特征测定。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述病原生物是艰难梭菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。22.根据权利要求10所述的方法，其中所述生物样本是大便样本，并且所述方法进一步包括将所得序列与代表健康微生物之序列的对照组进行比较，从而针对移植入需要健康肠道微生物的患者确定所述粪便样本的适用性，或确定所述样本中指示癌症之异常细胞的存在性。23.根据权利要求10所述的方法，进一步包括将所得序列与代表法医学数据组之序列的对照组进行比较，从而鉴定所述样本的来源，或所述样本之宿主来源的衰变程度。24.一种从包含RNA和RNA分析-干扰物的环境或生物样本中分离RNA的方法，所述方法包括：a.使所述样本与RNA稳定剂接触；b.使用机械搅拌、酶促处理、化学处理、热处理或其组合破裂所述样本以产生裂解物；以及c.使所述裂解物、其体积部分、其上清液或其上清液的体积部分与权利要求1所述的组合物接触，以形成含干扰物的沉淀物和含RNA的干扰物耗尽溶液；以及d.从所述含RNA的干扰物耗尽溶液中分离RNA以形成分离的RNA。25.根据权利要求24所述的方法，其中破裂所述样本为在存在包含至少一种离液剂的裂解试剂的条件下的化学处理，其中所述裂解试剂不含乙酸铵、氯化钠、硫酸铵、乙酸钾或乙酸钠。26.根据权利要求24所述的方法，其中所述组合物包含5mM至200mM乙酸铵和5mM至200mM絮凝剂的溶液。27.根据权利要求24所述的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：A弗拉索夫，S拉罗卡，M李，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US