The techniques provided in this article involve amplification based detection of DNA treated with sulfite, specifically involving but not only a multiple amplification method and composition for the further characterization of the low level sample DNA before the further characterization of sample DNA. The technology also provides a method for separating DNA from blood or blood product samples, such as plasma samples.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】血浆DNA的多重扩增检测测定以及分离和检测相关申请的交叉引用。本申请要求于2015年10月30日提交的美国临时申请序列第62/249,097号的优先权,所述美国临时申请序列通过引用并入本文。专利
本文提供的技术涉及核酸的基于扩增的检测,具体地涉及(但非仅涉及)在进一步表征样品DNA之前用于低水平样品DNA的多重扩增的方法和组合物。该技术还提供了从血液或血液产品样品例如血浆样品分离DNA的方法。背景定量核酸的方法在分子生物学的许多领域中,特别是对于分子诊断是重要的。在DNA水平上,例如使用此类方法来确定变体等位基因的存在或不存在、在基因组中扩增的基因序列的拷贝数,以及甲基化在基因间或基因内的特定基因座上的量、存在或不存在。另外,使用定量核酸的方法将mRNA的量测定为基因表达的量度。在检测和定量核酸或核酸序列的多种不同分析方法中,聚合酶链式反应(PCR)的变体已成为最强大和最普遍的技术,其原理已在美国专利第4,683,195号、第4,683,202号和第4,965,188中公开。检测以低水平存在于样品中的核酸(例如来自疾病基因座,例如肿瘤的DNA,其从远离疾病基因座的样品收集,例如,进入粪便、痰液、尿液、血浆等等中的DNA,“远程DNA样本”)可能很困难,部分原因在于此类样本中发现的许多DNA不仅数量少,而且它们通常也是片段化的。参见,例如,属于Ballhause的WO2006/113770以及属于Davos的美国专利公开US201110009277A1,其中的每一篇通过引用整体并入本文。例如,血浆中发现的无细胞DNA(cfDNA)可以是高度片段化的,并且 ...
【技术保护点】
1.一种分析多个靶核酸的样品的方法,所述方法包括:a)提供具有体积x的样品,所述样品包含疑似含有多个n个不同靶区域中的一个或多个的经亚硫酸氢盐处理的DNA,其中至少一个所述靶区域是低拷贝靶标,如果存在于所述样品中,其以这样的拷贝数存在于所述样品中,使得:i)在所述样品的n个部分中每个部分具有x/n的体积,所述n个部分中的一个或多个不存在所述低拷贝靶标,或ii)在所述样品的n个部分中每个部分具有x/n的体积,所述n个部分中的一个或多个中的所述低拷贝靶标低于用于所述低拷贝靶标的检测测定的灵敏度水平;b)在其中在所述n个不同靶区域存在于所述样品中时,扩增所述靶区域以形成具有体积y的预扩增的混合物的条件下,将所述样品的所述体积x处理至扩增反应;c)将所述预扩增的混合物分配至多个不同的检测测定反应混合物中,其中每个检测测定反应混合物包含一部分所述预扩增的混合物,所述预扩增的混合物具有y/n或更小的体积,并且其中所述低拷贝靶标,如果在步骤a)中存在于所述样品中,则存在于每个所述检测测定反应混合物中;d)用所述检测测定反应混合物进行多个检测测定,其中所述不同的靶区域,如果在步骤a)中存在于所述样品中 ...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.30 US 62/249,0971.一种分析多个靶核酸的样品的方法,所述方法包括:a)提供具有体积x的样品,所述样品包含疑似含有多个n个不同靶区域中的一个或多个的经亚硫酸氢盐处理的DNA,其中至少一个所述靶区域是低拷贝靶标,如果存在于所述样品中,其以这样的拷贝数存在于所述样品中,使得:i)在所述样品的n个部分中每个部分具有x/n的体积,所述n个部分中的一个或多个不存在所述低拷贝靶标,或ii)在所述样品的n个部分中每个部分具有x/n的体积,所述n个部分中的一个或多个中的所述低拷贝靶标低于用于所述低拷贝靶标的检测测定的灵敏度水平;b)在其中在所述n个不同靶区域存在于所述样品中时,扩增所述靶区域以形成具有体积y的预扩增的混合物的条件下,将所述样品的所述体积x处理至扩增反应;c)将所述预扩增的混合物分配至多个不同的检测测定反应混合物中,其中每个检测测定反应混合物包含一部分所述预扩增的混合物,所述预扩增的混合物具有y/n或更小的体积,并且其中所述低拷贝靶标,如果在步骤a)中存在于所述样品中,则存在于每个所述检测测定反应混合物中;d)用所述检测测定反应混合物进行多个检测测定,其中所述不同的靶区域,如果在步骤a)中存在于所述样品中,则在所述检测测定反应混合物中被检测到。2.根据权利要求1所述的方法,其中所述经亚硫酸氢盐处理的DNA来自人受试者。3.根据权利要求1或2所述的方法,其中从体液制备所述样品。4.根据权利要求3所述的方法,其中所述体液包括血浆。5.根据权利要求4所述的方法,其中由从血浆分离的无细胞DNA制备所述样品。6.根据权利要求5所述的方法,其中所述无细胞DNA的长度小于200个碱基对。7.根据权利要求5所述的方法,其中所述无细胞DNA通过方法从所述血浆分离而来,所述方法包括:a)将所述血浆样品与以下试剂组合:ⅰ)蛋白酶;和ii)第一裂解试剂,所述第一裂解试剂包含-硫氰酸胍;和-非离子型去污剂;以形成其中蛋白质被所述蛋白酶消化的混合物;b)在其中DNA与所述二氧化硅颗粒结合的条件下向步骤a)的混合物中添加iii)二氧化硅颗粒,和iv)第二裂解试剂,所述第二裂解试剂包含:-硫氰酸胍;-非离子型去污剂;和-异丙醇;c)从b)的混合物中分离具有结合的DNA的二氧化硅颗粒;d)向具有结合的DNA的分离的二氧化硅颗粒中添加所述第一种洗涤溶液,所述第一种洗涤溶液包含:i)盐酸胍或硫氰酸胍,和ii)乙醇;e)从所述第一洗涤溶液分离具有结合的DNA的二氧化硅颗粒;f)向具有结合的DNA的分离的二氧化硅颗粒中添加所述第二洗涤溶液,所述第二洗涤溶液包含缓冲剂和乙醇;g)从所述第二洗涤溶液中分离洗涤的具有结合的DNA的二氧化硅颗粒;和h)从所述洗涤的具有结合的DNA的二氧化硅颗粒洗脱DNA。8.根据权利要求7所述的方法,其中所述蛋白酶是蛋白酶K蛋白酶。9.根据权利要求3-8中任一项所述的方法,其中从至少1mL,优选至少5mL,更优选至少10mL体液制备所述样品,和/或其中所述样品的体积x为至少10μl,优选至少25μl,更优选至少50μl,更优选至少100μl,并且其中步骤b的扩增反应中的所述样品的体积为至少20至50%的扩增反应的总体积。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中n为至少3,优选至少5,更优选至少10,更优选至少20。11.一种使用PCR预扩增和PCR-瓣测定分析样品中的多个靶核酸的方法,所述方法包括:a)在包含PCR扩增试剂的第一反应混合物中提供包含多个不同靶区域的经亚硫酸氢盐处理的DNA,其中所述PCR扩增试剂包含:i)多个不同的引物对,其用于在所述靶区域存在于所述样品中时,从所述经亚硫酸氢盐处理的DNA中扩增所述多个不同的靶区域;ii)热稳定性DNA聚合酶;iii)dNTP;和iv)包含Mg++的缓冲液b)将所述第一反应混合物暴露于热循环条件,其中多个不同的靶区域,如果存在于样品中,被扩增以产生预扩增的混合物,并且其中所述热循环条件限于将扩增保持在指数范围内的多个热循环,优选少于20个,更优选少于15个,更优选10个或更少的热循环;c)将所述预扩增的混合物分配到多个PCR-瓣测定反应混合物中,其中每个PCR-瓣测定反应混合物包含:i)额外量的选自步骤a)i)的所述多个不同引物对的引物对;ii)热稳定性DNA聚合酶;iii)dNTP;iv)所述包含Mg++的所述缓冲液v)瓣核酸内切酶;vi)瓣寡核苷酸,和vi)包含与所述瓣寡核苷酸的一部分互补的区域的发夹寡核苷酸;和d)检测PCR-瓣测定反应期间来自所述经亚硫酸氢盐处理的DNA的一个或多个不同靶区域的扩增。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其中在所述分配之前用稀释剂稀释所述预扩增的混合物。13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法,其中将添加至所述PCR-瓣测定反应混合物中的额外量的引物对中的所述引物添加至一定浓度,使得所述PCR-瓣测定中所添加的引物的浓度基本上与所述PCR扩增试剂中的该引物对的引物浓度相同。14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法,其中所述发夹寡核苷酸包含荧光团部分。15.根据权利要求14所述的方法,其中所述发夹寡核苷酸是FRET盒寡核苷酸。16.根据权利要求11-15中任一项所述的方法,其中所述包含Mg++的缓冲液包含约6至10mMMg++。17.根据权利要求16所述的方法,其中所述包含Mg++的缓冲液包含约7.5mMMg++。18.根据权利要求11-17中任一项所述的方法,其中所述包含Mg++的缓冲液含有小于1mM的KCl。19.根据权利要求11至18中任一项所述的方法,其中所述包含Mg++的缓冲液包含10mM3-(正-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液和7.5mMMgCl2。20.根据权利要求11-19中任一项所述的方法,其中所述第一反应混合物和/或所述多个PCR-瓣测定反应混合物包含外源非靶DNA。21.根据权利要求20所述的方法,其中所述外源非靶DNA是本体鱼DNA。22.根据权利要求11-21中任一项所述的方法,其中所述热稳定性DNA聚合酶来自水生栖热菌。23.根据权利要求11-22中任一项所述的方法,其中所述热稳定性DNA聚合酶被修饰用于热启动PCR。24.根据权利要求11-23中任一项所述的方法,其中所述瓣核酸内切酶是FEN-1核酸内切酶。25.根据权利要求24所述的方法,其中所述FEN-1核酸内切酶来自古细菌生物体。26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法,其中所述经亚硫酸氢盐处理的DNA包含人DNA。27.根据权利要求26所述的方法,其中所述多个不同靶区域包含选自由SFMBT2、VAV3、BMP3和NDRG4组成的组的靶区域。28.根据权利要求26所述的方法,其中所述多个不同靶区域包括参考靶区域。29.根据权利要求28所述的方法,其中所述参考靶区域包含β-肌动蛋白和/或ZDHHC1和/或B3GALT6。30.根据权利要求11-29中任一项所述的方法,其中选择所述多个不同引物对中的至少一个以从长度小于约100个碱基对的靶区域产生扩增子。31.根据权利要求30所述的方法,其中选择所述多个不同引物对中的每一个以从长度小于约100个碱基,优选长度小于约85个碱基对的靶区域产生扩增子。32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法,其中在所述预扩增的混合物中或所述第一反应混合物中包含经亚硫酸氢盐处理的DNA的样品的体积为20-50%的所述预扩增的混合物或所述第一反应混合物的总体积。33.一种处理血浆样品的方法,所述方法包括:a)将血浆样品与以下试剂组合:ⅰ)蛋白酶;ii)第一裂解试剂,所述第一裂解试剂包含-硫氰酸胍,-非离子型去污剂;以形成其中蛋白质被所述蛋白酶消化的混合物;b)在其中DNA与所述二氧化硅颗粒结合的条...
【专利技术属性】
技术研发人员:H阿拉维,GP利德加德,B艾曾斯坦,TJ桑德尔,M贾库莫普洛斯,MW凯泽,MM格雷,AM瓦卡罗,
申请(专利权)人:精密科学发展有限责任公司,
类型:发明
国别省市:美国,US
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。