以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法技术

以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法，本发明专利技术属于生物技术领域，它为了解决水体环境病毒宏基因组研究中病毒浓缩液中存在少量的寄主细胞，影响测序结果的问题。水体环境病毒宏基因组解析的方法：一、水样经纱布过滤，通过过滤系统的滤柱去除细菌，浓缩后离心处理，配置病毒颗粒超离浓缩液；二、向浓缩液中加入DNase和RNase工作液，进行PCR扩增，检测是否消化彻底，如没有消化彻底，则加入溶菌酶裂解细菌细胞，继续消化，高温灭活核酸酶，得到不含寄主遗传物质污染的病毒颗粒浓缩液：三、扩增病毒全基因组。本发明专利技术通过溶菌酶处理样品，将污染细菌细胞DNA释放出来，然后被核酸酶消解掉操作简便、适用性强。

Metagenomic analysis for elimination of host DNA pollution in water environment viruses

In order to solve the problem that a small amount of host cells exist in the virus concentrated liquid in the study of the macro genome of the water environment virus, the method of eliminating the host DNA pollution in the macrogenome analysis of the water environment virus is a method to solve the problem of the sequencing results. The method of macrogenome analysis of water environment virus: (1) the water sample is filtered by gauze, the bacteria are removed by filter column of the filter system, and then centrifuged and centrifuged after concentration. Two, DNase and RNase work liquid is added into the concentrated liquid to carry out PCR amplification and test whether digestion is thorough, such as no digestion thoroughly. In addition, the lysozyme was added to lyse bacterial cells, to continue digestion, to inactivate nuclease at high temperature, and to obtain virus particle concentrate without host genetic material pollution: three, the whole genome of the virus was amplified. The present invention can release DNA from contaminated bacterial cells by lysozyme treatment of samples, and then be digested by nuclease. The operation is simple and the applicability is strong.

【技术实现步骤摘要】
以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于水体环境病毒宏基因组解析的方法。
技术介绍
宏基因组学(Metagenomics)利用新一代高通量测序技术(NGS)在分析微生物多样性、种群结构和进化关系的基础上，可进一步探究微生物群体功能、相互作用及与环境之间的关系，发掘潜在的生物学意义。病毒是地球上数量最多的生命体，保守估计在1031以上。与具有细胞形态的其它微生物，如细菌和真菌等相比较，学术界对自然环境中病毒多样性、基因组成和生态功能的认识还处于初级阶段，病毒常被喻为地球生物未知的“暗物质”。将宏基因组学的研究方法应用到环境病毒研究，即形成了病毒宏基因组学(ViralMetagenomics)是解析环境病毒基因组成、明确其多样性及生态功能最有效地方法。该方法主要通过纯化浓缩环境或生物体组织中病毒颗粒，提取其遗传物质进行高通量测序，然后通过序列拼接及生物信息学分析来解析环境病毒的基因组成。目前，国际上对环境微生物宏基因组学研究非常广泛，但对于病毒宏基因组学研究还存在许多瓶颈问题亟待解决，其中关键的问题之一是在环境病毒分离浓缩过程中，寄主细胞和寄主游离遗传物质混杂在浓缩的病毒溶液中，这些来自寄主的遗传物质如不能去除，无疑会对后续病毒全基因组扩增和基因组解析带来干扰，影响测序结果的真实性。目前，国际上针对水体环境病毒宏基因组研究较多，其通用的技术是采用不同孔径微孔膜分离、浓缩病毒溶液，然后向病毒溶液添加一定浓度的脱氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(RNase)以消除游离的寄主遗传物质污染，但研究发现，尽管采用不同孔径膜分离技术，在病毒浓缩液中还可能存在少量的寄主细胞(主要是细菌)。由于细菌细胞内的遗传物质DNA受到细胞膜的保护，没有游离出来，不能被DNase和RNase消化去除，从而对样品造成污染，对后续测序产生影响。
技术实现思路
本专利技术是为了解决水体环境病毒宏基因组研究中病毒浓缩液中存在少量的寄主细胞，影响测序结果的问题，而提供一种以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法。本专利技术以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法按以下步骤实现：一、水体病毒颗粒分离浓缩：a、采集野外水体，得到水样；b、水样经多层尼龙纱布过滤，然后通过切向流过滤系统的滤柱去除细菌，得到病毒颗粒溶液；c、病毒颗粒溶液经切向流过滤系统的滤柱浓缩，得到病毒颗粒浓缩液；d、将病毒颗粒浓缩液加到超速离心管中，在超速离心管底部加入质量浓度为19％～21％的蔗糖溶液，然后进行离心处理，得到离心后的病毒颗粒浓缩液；e、倒出超速离心管内液体后倒置在滤纸上静置，再用灭菌超纯水重悬附着在超速离心管底部管壁的病毒颗粒，得到病毒颗粒超离浓缩液；二、病毒浓缩液寄主遗传物质消除：f、向步骤e的病毒颗粒超离浓缩液中加入DNase和RNase工作液，在36～38℃条件下水浴处理，得到酶解的病毒颗粒浓缩液；g、从步骤f酶解的病毒颗粒浓缩液中取出1～2μL，采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增，用于检测是否有寄主遗传物质污染；当凝胶电泳检测没有目标条带，则表明消除寄主遗传物质污染，然后将无寄主DNA污染病毒浓缩液在78～82℃金属浴上处理，灭活浓缩液中的DNase和RNase酶活性，得到不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液；当凝胶电泳检测有目标PCR条带，则表明存在寄主遗传物质污染，向步骤f酶解的病毒颗粒浓缩液加入溶菌酶，在36～38℃条件下水浴2.5～3.5h，然后取出1～2μL采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增，凝胶电泳检测没有目标条带，表明消除寄主遗传物质污染，然后无寄主DNA污染病毒浓缩液在78～82℃金属浴上处理，灭活浓缩液中的DNase和RNase酶活性，得到不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液；三、病毒宏基因组提取及全基因组扩增：h、采用试剂盒提取不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液的病毒基因组，再对获得的病毒基因组进行多重置换全基因组扩增(MDA)，所得MDA病毒宏基因组样品经沉淀纯化后，进行病毒宏基因组测序分析。本专利技术与通用的单纯利用不同孔径微孔膜分离浓缩环境病毒样品相比，在浓缩过程中会有寄主细胞还存在于病毒浓缩液中的现象，如再次采用膜分离技术不可避免地会导致病毒颗粒的丢失，增加了研究流程和成本。而本专利技术利用溶菌酶的特性处理病毒浓缩液，由于病毒外壳为蛋白质，不是溶菌酶的作用靶点，而细菌细胞膜在溶菌酶的作用下破裂，细菌遗传物质被释放出来，从而被病毒浓缩液中添加的DNase和RNase酶消解去除，得到不含寄主遗传物质污染的病毒颗粒浓缩液，满足后续实验需求，保证了测序结果的质量。附图说明图1为实施例中溶菌酶消解前后，利用细菌通用引物27F/1492R的PCR检测图谱；图2为湿地水体样品经溶菌酶消解后获得病毒颗粒浓缩液经过SYBRGreenI核酸染料染色后得到的荧光显微镜观察图。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法按以下步骤实施：一、水体病毒颗粒分离浓缩：a、采集野外水体，得到水样；b、水样经多层尼龙纱布过滤，然后通过切向流过滤系统的滤柱去除细菌，得到病毒颗粒溶液；c、病毒颗粒溶液经切向流过滤系统的滤柱浓缩，得到病毒颗粒浓缩液；d、将病毒颗粒浓缩液加到超速离心管中，在超速离心管底部加入质量浓度为19％～21％的蔗糖溶液，然后进行离心处理，得到离心后的病毒颗粒浓缩液；e、倒出超速离心管内液体后倒置在滤纸上静置，再用灭菌超纯水重悬附着在超速离心管底部管壁的病毒颗粒，得到病毒颗粒超离浓缩液；二、病毒浓缩液寄主遗传物质消除：f、向步骤e的病毒颗粒超离浓缩液中加入DNase和RNase工作液，在36～38℃条件下水浴处理，得到酶解的病毒颗粒浓缩液；g、从步骤f酶解的病毒颗粒浓缩液中取出1～2μL，采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增，用于检测是否有寄主遗传物质污染；当凝胶电泳检测没有目标条带，则表明消除寄主遗传物质污染，然后将无寄主DNA污染病毒浓缩液在78～82℃金属浴上处理，灭活浓缩液中的DNase和RNase酶活性，得到不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液；当凝胶电泳检测有目标PCR条带，则表明存在寄主遗传物质污染，向步骤f酶解的病毒颗粒浓缩液加入溶菌酶，在36～38℃条件下水浴2.5～3.5h，然后取出1～2μL采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增，凝胶电泳检测没有目标条带，表明消除寄主遗传物质污染，然后无寄主DNA污染病毒浓缩液在78～82℃金属浴上处理，灭活浓缩液中的DNase和RNase酶活性，得到不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液；三、病毒宏基因组提取及全基因组扩增：h、采用试剂盒提取不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液的病毒基因组，再对获得的病毒基因组进行多重置换全基因组扩增(MDA)，所得MDA病毒宏基因组样品经沉淀纯化后，进行病毒宏基因组测序分析。本实施方式所述的野外水体为稻田田面水、湖泊河流水体或湿地水体等，水样样品25～50L。本实施方式提供了一种以消除寄主遗传物质污染，用于水体环境病毒宏基因组解析的方法，通过该方法能够得到无寄主遗传物质污染，纯度较高的病毒颗粒浓缩液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法，其特征在于该方法按以下步骤实现：一、水体病毒颗粒分离浓缩：a、采集野外水体，得到水样；b、水样经多层尼龙纱布过滤，然后通过切向流过滤系统的滤柱去除细菌，得到病毒颗粒溶液；c、病毒颗粒溶液经切向流过滤系统的滤柱浓缩，得到病毒颗粒浓缩液；d、将病毒颗粒浓缩液加到超速离心管中，在超速离心管底部加入质量浓度为19％～21％的蔗糖溶液，然后进行离心处理，得到离心后的病毒颗粒浓缩液；e、倒出超速离心管内液体后倒置在滤纸上静置，再用灭菌超纯水重悬附着在超速离心管底部管壁的病毒颗粒，得到病毒颗粒超离浓缩液；二、病毒浓缩液寄主遗传物质消除：f、向步骤e的病毒颗粒超离浓缩液中加入DNase和RNase工作液，在36～38℃条件下水浴处理，得到酶解的病毒颗粒浓缩液；g、从步骤f酶解的病毒颗粒浓缩液中取出1～2μL，采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增，用于检测是否有寄主遗传物质污染；当凝胶电泳检测没有目标条带，则表明消除寄主遗传物质污染，然后将无寄主DNA污染病毒浓缩液在78～82℃金属浴上处理，灭活浓缩液中的DNase和RNase酶活性，得到不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液；当凝胶电泳检测有目标PCR条带，则表明存在寄主遗传物质污染，向步骤f酶解的病毒颗粒浓缩液加入溶菌酶，在36～38℃条件下水浴2.5～3.5h，然后取出1～2μL采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增，凝胶电泳检测没有目标条带，表明消除寄主遗传物质污染，然后无寄主DNA污染病毒浓缩液在78～82℃金属浴上处理，灭活浓缩液中的DNase和RNase酶活性，得到不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液；三、病毒宏基因组提取及全基因组扩增：h、采用试剂盒提取不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液的病毒基因组，再对获得的病毒基因组进行多重置换全基因组扩增，所得MDA病毒宏基因组样品经沉淀纯化后，进行病毒宏基因组测序分析。...

【技术特征摘要】
1.以消除寄主DNA污染用于水体环境病毒宏基因组解析的方法，其特征在于该方法按以下步骤实现：一、水体病毒颗粒分离浓缩：a、采集野外水体，得到水样；b、水样经多层尼龙纱布过滤，然后通过切向流过滤系统的滤柱去除细菌，得到病毒颗粒溶液；c、病毒颗粒溶液经切向流过滤系统的滤柱浓缩，得到病毒颗粒浓缩液；d、将病毒颗粒浓缩液加到超速离心管中，在超速离心管底部加入质量浓度为19％～21％的蔗糖溶液，然后进行离心处理，得到离心后的病毒颗粒浓缩液；e、倒出超速离心管内液体后倒置在滤纸上静置，再用灭菌超纯水重悬附着在超速离心管底部管壁的病毒颗粒，得到病毒颗粒超离浓缩液；二、病毒浓缩液寄主遗传物质消除：f、向步骤e的病毒颗粒超离浓缩液中加入DNase和RNase工作液，在36～38℃条件下水浴处理，得到酶解的病毒颗粒浓缩液；g、从步骤f酶解的病毒颗粒浓缩液中取出1～2μL，采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增，用于检测是否有寄主遗传物质污染；当凝胶电泳检测没有目标条带，则表明消除寄主遗传物质污染，然后将无寄主DNA污染病毒浓缩液在78～82℃金属浴上处理，灭活浓缩液中的DNase和RNase酶活性，得到不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液；当凝胶电泳检测有目标PCR条带，则表明存在寄主遗传物质污染，向步骤f酶解的病毒颗粒浓缩液加入溶菌酶，在36～38℃条件下水浴2.5～3.5h，然后取出1～2μL采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增，凝胶电泳检测没有目标条带，表明消除寄主遗传物质污染，然后无寄主DNA污染病毒浓缩液在78～82℃金属浴上处理，灭活浓缩液中的DNase和RNase酶活性，得到不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液；三、病毒宏基因组提取及全基因组扩增：h、采用试剂盒提取不含寄主遗传物质的病毒颗粒浓缩液的病毒基因组，再对获得的病毒基因组进行多重置换全基因组扩增，所得MDA病毒宏基因组样品经沉淀纯化后，进行病毒宏基因组测序分析。2.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王光华，孙岩，王新珍，刘俊杰，
申请(专利权)人：中国科学院东北地理与农业生态研究所，
类型：发明
国别省市：吉林,22