一种BRAF基因突变检测的引物探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基因突变的检测产品，具体涉及一种BRAF基因突变检测的引物探针组合及其应用，所述引物探针组合包括检测引物探针，所述检测引物探针包括BRAF基因V600E突变检测特异性引物对、BRAF基因特异性探针、扩增阻断探针和内参系统；其中，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的错配率为15‑30％。本发明专利技术对BRAF基因突变具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，可以对肿瘤组织样本进行检测，能够辅助临床治疗，具有重要价值。

Primer probe combination for detection of BRAF gene mutation and its application

The invention relates to a detection product of gene mutation, in particular to a combination of primer probes for detection of BRAF gene mutation and its application. The primer probe combination includes the detection of primer probes, and the detection primer probes include BRAF gene V600E mutation detection specific primer pairs, BRAF specific probes, and amplification blocking probes. The mismatch rate of the BRAF gene V600E mutation detected by specific primer pairs was 15 30%. This invention has the advantages of high specificity, high sensitivity and simple and rapid operation of BRAF gene mutation. The detection results have good accuracy and repeatability. It can be used to detect tumor tissue samples and can assist clinical treatment. It is of great value.

【技术实现步骤摘要】
一种BRAF基因突变检测的引物探针组合及其应用
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种基因突变的检测产品，具体涉及一种BRAF基因突变检测的引物探针组合及其应用。
技术介绍
根据全国肿瘤登记中心发布的《2014中国肿瘤登记年报》，每分钟就有6人确诊为癌症，即每天有8550个新增癌症患者，每年为312万。同时，死亡270万。我国近20年来癌症呈现年轻化、发病率、死亡率“三线”走高的趋势。加上治疗中的病人，保守估计全国活着的癌症患者共计500万人以上。肿瘤治疗市场容量在3000亿以上，并且逐年递增。B-raf基因位于染色体7q34，是一种癌基因，编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，是EGFR通路重要的转导因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡多种生理过程。B-raf基因突变存在于非小细胞肺癌、结直肠癌、黑色素瘤和甲状腺癌等多种恶性肿瘤中，90％以上为V600E。B-rafV600E突变可导致部分KRAS基因野生型患者对EGFR-TKI及EGFR单抗药物治疗不敏感。因此，推荐肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗前，进行B-raf基因V600E突变的检测。2011年版《NCCN结直肠癌临床实践指南》中明确指出结直肠癌患者应进行B-raf基因V600E突变的检测，如果患者存在V600E突变时，一线治疗进展后使用抗EGFR单抗治疗是无效的。B-raf基因突变检测能提高临床治疗的针对性，指导靶向药物的合理使用，避免无效或治疗不当造成的病人病情延误，降低治疗风险。ARMS-PCR(AmplificationRefractoryMutationSystem，突变扩增阻滞系统)技术，是一种利用序列特异性引物对模板进行选择性扩增而达到检测基因突变的方法。ARMS技术利用TaqDNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，针对不同的已知突变，设计适当的引物以检测出突变基因(即利用特异引物对突变靶序列进行高精准的PCR扩增放大)；同时利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测。市场上现有的个性化用药基因检测试剂，CN105567854A公开了一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的ARMS引物，其在ARMS实时荧光定量技术中引入了双内参系统，还增加了和突变位点一致的正常位点参照，使其成为双内参系统和双重判读规则的试剂盒。CN104099425A公开了一种用于检测B-raf基因突变的试剂盒，包括质控引物探针内标混合液和检测引物探针内标混合液，该试剂盒将扩增阻碍突变系统和末端磷酸化的野生型扩增阻断核酸序列相结合，将脱氧次黄嘌呤引入到检测B-raf基因V600E突变检测特异性正向ARMS引物中，使每个样本的检测平行进行质控PCR反应和检测PCR反应。但上述方法操作相对复杂，成本较高，病人不容易接受，难以在大范围内普及使用。近年非常令人兴奋的是预测性基因检测的开展，利用基因检测技术在疾病发生前发现疾病发生的风险，提早预防，由于大部分肿瘤突变是体细胞突变，突变细胞常常与野生型细胞混合在一起，因此所获得的的DNA往往含大量的野生型背景，对体细胞突变的检测就需要一种高特异性和高灵敏度的检测方法。因此，高效、准确的检测BRAF基因突变就显得极为重要。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种BRAF基因突变检测的引物探针组合及其应用，所述试剂盒能够检测速度快，具有很高的特异性和灵敏度。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种BRAF基因突变检测的引物探针组合，所述引物探针组合包括检测引物探针，所述检测引物探针包括BRAF基因V600E突变检测特异性引物对、BRAF基因特异性探针、扩增阻断探针和内参系统；其中，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的错配率为15-30％。本专利技术中，由于大部分肿瘤突变是体细胞突变，突变细胞常常与野生型细胞混合在一起，因此所获得的DNA往往含大量的野生型背景，因此引物、探针设计必须非常特异，专利技术人发现通过调节BRAF基因V600E突变检测特异性引物的错配率，使得绝大部分野生型背景与突变型检测无法结合，且通过增加G-C碱基的错配，使得20bp左右的引物就能达到与TaqmanMGB探针5-10℃的Tm差值，使得引物和探针的Tm差异符合MGB探针的设计原则，从而实现对样本中非特异性序列进行阻断扩增的目的，进一步提高检测的准确度和特异性，且仅仅只需要10ng的DNA样品就能够完成检测，检测灵敏度达到0.5％。根据本专利技术，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的错配率为15-30％，例如可以是15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％，优选为20-25％。根据本专利技术，所述扩增阻断探针与BRAF基因V600E突变检测特异性引物对中的下游引物的碱基重叠序列为3-10bp，例如可以是3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp或10bp，优选为6-9bp。本专利技术中，阻碍探针与突变型的引物bp长度基本一致，且序列3’端最后一个碱基与野生型序列一致，且3’端用磷酸基团封闭，从而抑制V600E突变区野生型模板的非特异性扩增，大大增加BRAF突变检测的灵敏度和特异性。根据本专利技术，专利技术人发现将扩增阻断探针的3’端进行磷酸化，有效的抑制了野生型基因的扩增，沉默了样本中非特异的连接，进一步提高检测的准确率。优选地，所述BRAF基因特异性探针和所述扩增阻断探针的5’端带有荧光基团，所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种或至少两种的组合，优选为FAM和/或NED。优选地，所述BRAF基因特异性探针和所述扩增阻断探针的3’端带有淬灭集团，所述淬灭基团选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate(PS)中的任意一种的组合，优选为MGB，所述MGB修饰在3’端。本专利技术中，专利技术人发现采用MGB作淬灭基团可以将探针的Tm值提高6-10℃左右，提高配对与非配对模板间的Tm值差异，用这种探针可以降低本底，因此检测的重复性和准确度得以大大提高。根据本专利技术，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示，具体序列如下：正向引物(SEQIDNO.1)：CCTAAACTCTTCATAATGCTTGCTC；反向引物(SEQIDNO.2)：CACTCCATCGAGATTTCT.根据本专利技术，所述BRAF基因特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，具体序列如下：CCTTTACTTACTACACCTCAGA.优选地，所述扩增阻断探针的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，具体序列如下：CGAGATTTCACTGTAGC.优选地，所述内参系统包括内参引物对和内参探针。优选地，所述内参引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.5-6所示，具体序列如下：正向引物(SEQIDNO.5)：GCGGGTTGTCCTTGAGAAAC；反向引物(SEQIDNO.6)：AATGGTCCACCCGGTAC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种BRAF基因突变检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括检测引物探针，所述检测引物探针包括BRAF基因V600E突变检测特异性引物对、BRAF基因特异性探针、扩增阻断探针和内参系统；其中，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的错配率为15‑30％。

【技术特征摘要】
1.一种BRAF基因突变检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括检测引物探针，所述检测引物探针包括BRAF基因V600E突变检测特异性引物对、BRAF基因特异性探针、扩增阻断探针和内参系统；其中，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的错配率为15-30％。2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的错配率为20-25％；优选地，所述扩增阻断探针与BRAF基因V600E突变检测特异性引物对中的下游引物的碱基重叠序列为3-10bp，优选为6-9bp。3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述扩增阻断探针的3’端磷酸化；优选地，所述BRAF基因特异性探针和所述扩增阻断探针的5’端带有荧光基团；优选地，所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种或至少两种的组合，优选为FAM和/或NED；优选地，所述BRAF基因特异性探针和所述扩增阻断探针的3’端带有淬灭集团；优选地，所述淬灭基团选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种或至少两种的组合，优选为MGB。4.根据权利要求1-3中任一项所述的引物探针组合，其特征在于，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示；优选地，所述BRAF基因特异性探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；优选地，所述扩增阻断探针的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；优选地，所述内参系统包括内参引物对和内参探针；优选地，所述内参引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.5-6所示；优选地，所述内参探针的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。5.一种检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项所述的引物探针组合物。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控、阳性质控和辅助试剂；优选地，所述阴性质控为TE缓冲液；优选地，所述阳性...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛青松，白静，姚鲁帅，
申请(专利权)人：无锡禾盛医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32