The invention discloses a specific method for detecting Toxoplasma gondii. The methods included the following steps: 1, reconstructing the sequence of SAG1 and SAG2 epitopes of Toxoplasma gondii; 2, connecting and transforming the target genes and vectors; 3, the expression and purification of the recombinant plasmid; 4, the expression of recombinant protein; 5, Western blot to detect the immunogenicity of the recombinant protein; and 6 and ELISA methods to analyze the immunogenicity of the recombinant protein. The method has the advantages of high sensitivity, simple operation and no two pollution.
【技术实现步骤摘要】
一种特异性的检测弓形虫的方法
:本专利技术涉及一种免疫检测方法,具体涉及一种特异性的检测弓形虫的方法。
技术介绍
:弓形虫属真球虫目,弓形虫科,是一种分布广泛的专性细胞内寄生虫,最早发现于1908年。该病呈世界性分布,广泛存在于温血动物中,其中猫科动物为其终宿主和重要的传染源。弓形虫感染人体后可使患者出现急性弓形虫脑炎而死亡。感染家畜后主要表现出流产、产死胎和弱畜,给人类和养殖业造成严重威胁。弓形虫速殖子是机体免疫系统识别的主要部位,其表膜蛋白抗原(SAG)由SAG基因家族编码。SAG1位于弓形虫速殖子表面,可以诱导宿主的免疫应答;SAG2是速殖子表膜的另一主要抗原,可介导弓形虫速殖子的入侵,这两种抗原均具有较强的免疫原性。目前,对血清特异性抗体进行检测时常用的是虫源性粗抗原,因其成分复杂,导致特异性较差,并容易产生交叉感染,最终影响检测效果。目前国内外学者多用从感染动物中收集或经组织、细胞培养的弓形虫速殖体作为抗原,该方法虽然操作方便,特异性较好,但抗原纯度较低,成分复杂,容易出现交叉反应。而在原核表达系统中表达出的特异性目的蛋白,因蛋白产量高、操作简单、费用低廉等优势,成为众多学者研究的对象。因此,建立一种重组抗原作为诊断抗原检测弓形虫病的方法势在必行。SAG1和SAG2抗原都是弓形虫速殖子期特异性表膜抗原,以糖磷脂酰化形式锚定在细胞膜上,以阻止吞噬细胞对侵袭的弓形虫进行吞噬消化。SAG1主要与弓形虫毒力相关,并己证实该基因编码的重组抗原可作为诊断抗原,用于弓形虫速殖子感染的免疫学检测;SAG2与弓形虫入侵宿主细胞有密切的关系,SAG2抗原可以使弓形虫 ...
【技术保护点】
1.一种特异性的检测弓形虫的方法,包括以下步骤:1)、重构弓形虫SAG1和SAG2抗原表位基因序列同SEQ ID NO:1所示;2)、将目的基因与PET‑28a(+)载体连接后,转化至感受态细胞,挑取完整单个菌落于LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜;之后进行菌液PCR、双酶切和测序鉴定;3)、菌液振荡培养至OD值为0.6—0.8时,加入IPTG诱导,于诱导前和诱导后1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h和8h分别收集菌液,离心,加入1×PBS进行SDS‑PAGE电泳,确定最佳的表达时相;4)、将诱导后的菌液离心,收集沉淀,用1×PBS重悬,反复冻融3次后,冰浴超声破碎后离心,收集上清,沉淀用尿素重悬,之后进行SDS‑PAGE电泳,对蛋白可溶性进行分析;使用His亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化,收集各段洗脱液样品;5)、将纯化后的带有His标签的重组蛋白进行SDS‑PAGE电泳,电转移至NC膜上,用脱脂奶粉封闭2h,PBST洗涤,加入1:100稀释的小鼠弓形虫阳性血清,4℃孵育过夜,同样方法洗涤,加入1∶2000稀释的羊抗鼠IgG‑HRP,室温孵育1h,洗涤后,HRP‑DAB底物 ...
【技术特征摘要】
1.一种特异性的检测弓形虫的方法,包括以下步骤:1)、重构弓形虫SAG1和SAG2抗原表位基因序列同SEQIDNO:1所示;2)、将目的基因与PET-28a(+)载体连接后,转化至感受态细胞,挑取完整单个菌落于LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜;之后进行菌液PCR、双酶切和测序鉴定;3)、菌液振荡培养至OD值为0.6—0.8时,加入IPTG诱导,于诱导前和诱导后1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h和8h分别收集菌液,离心,加入1×PBS进行SDS-PAGE电泳,确定最佳的表达时相;4)、将诱导后的菌液离心,收集沉淀,用1×PBS重悬,反复冻融3次后,冰浴超声破碎后离心,收集上清,沉淀用尿素重悬,之后进行SDS-PAGE电泳,对蛋白可溶性进行分析;使用His亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化,收集各段洗脱液样品;5)、将纯化后的带有His标签的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳,电转移至NC膜上,用脱脂奶粉封闭2h,PBST洗涤,加入1:100稀释的小鼠弓形虫阳性血清,4℃孵育过夜,同样方法洗涤,加入1∶2000稀释的羊抗鼠IgG...
【专利技术属性】
技术研发人员:朱传刚,王钊哲,许瑞,林矫矫,陈兆国,洪炀,陆珂,李浩,吴思敏,李嘉静,江嘉欣,
申请(专利权)人:中国农业科学院上海兽医研究所,
类型:发明
国别省市:上海,31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。