一种重组表达质粒及其制备方法、用途技术

本发明专利技术属于微生物学、基因工程和蛋白质工程领域，具体提供了一种重组表达质粒及其制备方法、用途，重组表达质粒包含：溶菌酶基因和核酸酶基因；核酸酶基因包括核酸酶基因序列和编码膜间质定位信号肽的基因序列；重组表达质粒可以稳定表达溶菌酶并积累在细胞质内，稳定表达的核酸酶积累在膜间质的空间中，两者的表达积累并不干扰菌体正常生长和目的蛋白的表达积累。当释放目的蛋白时，改变宿主细胞的通透性，溶菌酶进入膜间质空间中降解肽聚糖层，核酸酶进入细胞质中降解基因组核酸和质粒，使宿主细胞稳定可控发生自溶释放细胞内目的蛋白，同时降解所释放的核酸，时间短，释放目的蛋白的效率高，且无需使用昂贵的仪器或添加额外的溶菌酶，成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种重组表达质粒及其制备方法、用途
本专利技术属于微生物学、基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及一种可使宿主细胞稳定可控发生自溶进而高效率释放细胞内蛋白产物，并且同时降解所释放的核酸的重组表达质粒及其制备方法、用途。
技术介绍
蛋白质是生命的物质基础，是生命活动的主要承担者，一切重要的生命现象和生理机能都与蛋白质有关。在基础科研中，研究蛋白质的功能可以揭示出生命活动的机制。在工业生产和制药领域，蛋白质和多肽也是非常重要和必需的产品，如胰岛素、白细胞介素等。蛋白质通常是在体外获取，然后再进行一系列的生化操作和研究。目前，在体外生产蛋白质和多肽产品的蛋白表达系统中最常用的宿主细胞是大肠杆菌，具有操作方便、周期短和产量高等优点。大肠杆菌的细胞结构比较简单，具有细胞壁、细胞膜、细胞质等结构，无成形的细胞核，具体的结构为在细胞质外具有内、外两层膜结构，两层膜之间被称作膜间质空间，膜间质空间具有肽聚糖层，外膜和肽聚糖层共同组成了大肠杆菌的细胞壁。大肠杆菌表达的蛋白质或多肽通常位于大肠杆菌的细胞质内或者膜间质中，因此，在分离纯化目标蛋白之前，有效的将细胞破碎使目标蛋白释放出来是极其关键的步骤。由于肽聚糖层聚合成网状结构，具有一定的机械强度，因此大肠杆菌细胞破碎的主要阻力来自于位于膜间质空间的肽聚糖层。为克服上述肽聚糖层所带来的阻力、使菌体细胞有效的破碎，目前破碎菌体细胞的方法主要采用机械法、化学法和酶溶法等。但是上述方法存在如下缺陷：1)机械法包括使用高压破碎仪破碎、超声波破碎和珠磨法，均需要特殊的仪器设备，成本高，能量消耗大，同时产生的机械剪切力也可能会使目标蛋白产物失活；2)化学法是通过渗透压将细胞内容物释放，但其对产物的释放具有一定的选择性，效率低、通用性差；3)酶溶法是使用溶菌酶将肽聚糖层切断来使细胞破碎，目前常采用外加溶菌酶的方法进行破碎，但是酶产品价格高，限制了其大规模应用。为克服上述缺陷，科研人员提出了通过基因工程改造的方法使细菌宿主自身表达出裂解细菌的外源蛋白，使得细胞进行自溶，进而达到破碎细胞的目的，如中国农业科学院的周志刚等人将E7裂解蛋白与目标产物一起表达在宿主胞质内，但是该裂解蛋白的表达受到宿主代谢的影响，并且不可控，一旦表达出来就会开始裂解菌体，导致最终目标产物产量少，表达过程不稳定，释放效率不理想。另外，无论是使用化学法、酶溶法或是基因工程改造方法破碎菌体后，均会产生大量的核酸(菌体自身基因组以及转入的相关表达质粒)与目标蛋白一起释放，导致细胞悬浮液黏度大，使得后续分离纯化步骤操作困难，同时也可能会导致所用的表达质粒在最终蛋白产品中有残留，造成工具质粒的泄漏。目前解决破碎液中核酸的方法通常是额外加入核酸酶降解，如Novagen公司提供的产品按一定比例将溶菌酶和核酸酶混合，进行蛋白的抽提，但是由于酶产品成本很高，限制了其大规模的应用。也有科研人员提出了通过基因工程改造的方法使细菌宿主能够在膜间质空间表达核酸酶，同时细菌宿主再表达穿孔素等蛋白，在穿孔素等蛋白的作用下，可以将膜间质空间表达的核酸酶释放至细胞质中降解核酸，但是在该方法中，由于穿孔素等蛋白的大量表达，使得细菌宿主不受控裂解，影响菌体的生长，导致目标蛋白不能大量的积累，降低生产效率。因此，研发一种高效率低成本稳定可控的使菌体细胞内目标蛋白释放同时无核酸残留的方法，对于蛋白质的科学研究和工业生产都意义重大。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种可使大肠杆菌宿主稳定可控发生自溶，高效率释放目标蛋白产物并且同时降解释放的核酸(包括菌体自身基因组以及所转入的相关表达质粒)的重组表达质粒及其制备方法、用途。为此，本专利技术提供了一种重组表达质粒，所述重组表达质粒包含：溶菌酶基因和核酸酶基因；所述核酸酶基因包括核酸酶基因序列和编码膜间质定位信号肽的基因序列。所述重组表达质粒中的上述溶菌酶基因和核酸酶基因在宿主菌内能够适量表达，即所述重组表达质粒中包含有能够表达上述溶菌酶基因和核酸酶基因的表达盒。所述的重组表达质粒，所述重组表达质粒中启动溶菌酶基因和核酸酶基因表达的启动子序列或所述包含有能够表达上述溶菌酶基因和核酸酶基因的表达盒中的启动子序列选自：质粒J61002的常量表达启动子或质粒pSB1A2的常量表达启动子。所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。所述的重组表达质粒，所述溶菌酶基因选自λ噬菌体R溶菌酶基因、大肠杆菌素E7基因或PhiX174噬菌体溶菌酶E基因。所述溶菌酶的基因序列的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。所述核酸酶的基因序列选自粘质沙雷菌的核酸内切酶基因、T5噬菌体Dl5核酸外切酶基因、大肠杆菌RecBCD核酸外切酶基因或大肠杆菌endA核酸酶基因。所述的核酸酶的基因序列的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。所述编码膜间质定位信号肽的基因序列选自大肠杆菌的osmY基因、surA基因或dsbA基因。所述编码膜间质定位信号肽的基因序列的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。所述重组表达质粒，从5’端到3’端依次包括抗性基因表达盒、复制子序列、启动子、溶菌酶基因序列、膜间质定位信号肽基因序列、核酸酶基因序列和终止子序列。为了使所述重组表达质粒中的溶菌酶基因具有较高的翻译效率，所述的重组表达质粒中在溶菌酶基因的上游还包括膜间质前导肽基因序列。所述膜间质前导肽基因序列选自osmY基因前导肽序列、surA基因前导肽序列或skp基因前导肽序列。所述的膜间质前导肽基因序列的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，所述序列配合重组表达质粒上启动溶菌酶基因和核酸酶基因表达的启动子序列，可以保证所述溶菌酶基因维持一定较高的表达量。所述的重组表达质粒，所述溶菌酶基因和核酸酶基因在重组表达质粒中的位置或在表达上述溶菌酶基因和核酸酶基因的表达盒中自上游至下游依次为启动子序列、膜间质前导肽基因序列、溶菌酶基因序列、串联连接序列、编码膜间质定位信号肽的基因序列和核酸酶基因序列。所述串联连接序列如SEQIDNO:6所示。使用所述串联序列使得溶菌酶基因和核酸酶基因的表达程度相近，并且都维持在不影响菌体生长但可以充分发挥各自功能的较高的表达水平。所述的重组表达质粒，从5’端到3’端依次包括抗性基因表达盒、复制子序列、启动子、膜间质前导肽基因序列、溶菌酶基因序列、串联连接序列、膜间质定位信号肽基因序列、核酸酶基因序列和终止子序列。所述的终止子序列选自pBAD/Myc-HisA质粒载体上的终止子序列。所述抗性基因表达盒为氯霉素抗性基因表达盒，复制子序列为p15A，两者均来自载体pACYC184质粒。所述的重组表达质粒，用于构建所述的重组表达质粒的出发载体为可在大肠杆菌中表达外源基因的原核表达载体。所述的重组表达质粒，所述的出发载体为pBAD/Myc-HisA质粒。所述的重组表达质粒，所述的重组表达质粒的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。本专利技术提供了一种构建所述的重组表达质粒的方法，包括如下步骤：(1)分别将溶菌酶基因、核酸酶基因序列和编码膜间质定位信号肽的基因序列克隆至选定的质粒载体上，获得所述重组表达质粒；(2)将步骤(1)中获得的所述重组表达质粒转化至感受态细胞中，筛选、测序，选择测序结果正确的质粒载体。优选的，构建所述的重组表达质粒的方法，包本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒包含：溶菌酶基因和核酸酶基因；所述核酸酶基因包括核酸酶基因序列和编码膜间质定位信号肽的基因序列。

【技术特征摘要】
1.一种重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒包含：溶菌酶基因和核酸酶基因；所述核酸酶基因包括核酸酶基因序列和编码膜间质定位信号肽的基因序列。2.根据权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒中的启动溶菌酶基因和核酸酶基因表达的启动子序列选自：质粒J61002的常量表达启动子或质粒pSB1A2的常量表达启动子。3.根据权利要求1或2所述的重组表达质粒，其特征在于，所述溶菌酶基因选自大肠杆菌素E7基因、λ噬菌体溶菌酶R基因或PhiX174噬菌体溶菌酶E基因；所述核酸酶基因序列选自大肠杆菌RecBCD核酸外切酶基因、粘质沙雷菌的核酸内切酶基因、T5噬菌体Dl5核酸外切酶基因或大肠杆菌endA核酸酶基因；所述编码膜间质定位信号肽的基因序列选自大肠杆菌的osmY基因、surA基因或dsbA基因。4.根据权利要求1-3任一项所述的重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒，从5’端到3’端依次包括抗性基因表达盒、复制子序列、启动子、溶菌酶基因序列、膜间质定位信号肽基因序列、核酸酶基因序列和终止子序...

【专利技术属性】
技术研发人员：昌增益，刘洋，余家钰，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11