一种铅离子敏感型全细胞生物传感器的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种铅离子敏感的具有基因级联放大表达系统的全细胞生物传感器及构建方法；将人工全合成双向启动子Ppbr以及铅离子特异性结合蛋白PbrR如SEQ ID No.1所示核苷酸序列与质粒pGN68所含自反馈调控蛋白LuxR的SEQ ID No.4的核苷酸序列通过酶切方式连接，筛选阳性克隆得到目标重组载体pET28a‑pbr‑lux；质粒pGN68含有自反馈启动子PluxRI、绿色荧光蛋白基因核苷酸序列、自反馈调控蛋白LuxR核苷酸序列，按照酶切方式依次连接；利用大肠杆菌E.coli DH5α作为宿主，将重组载体以及质粒pGN68共转化，得到对铅离子敏感性的全细胞生物传感器。

A method for constructing lead ion sensitive whole cell biosensor

The present invention relates to a whole cell biosensor with a lead ion sensitive gene cascade amplification system and a method of construction. The nucleotide sequence of the synthetic bidirectional promoter Ppbr and the lead ion specific binding protein PbrR, such as SEQ ID No.1, and the SEQ ID No.4 of the self feedback regulation protein LuxR contained in the plasmid pGN68 The nucleotide sequence was linked by enzyme cutting, and the positive clones were screened to obtain the target recombinant vector pET28a PBR lux, and plasmid pGN68 contained the self feedback promoter PluxRI, the nucleotide sequence of the green fluorescent protein gene, the self feedback regulation protein LuxR nucleotide sequence, and the secondary connection according to the enzyme cutting mode; the Escherichia coli E.coli DH5 alpha was used. As a host, the recombinant vector and plasmid pGN68 were co transformed to obtain a whole cell biosensor for sensitivity to lead ions.

【技术实现步骤摘要】
一种铅离子敏感型全细胞生物传感器的构建方法
本专利技术涉及一种可检测水性环境中铅离子含量的敏感型全细胞生物传感器的构建与使用，用于对铅离子进行定量以及重金属污染修复提供帮助。
技术介绍
铅是人类所需要且毒性很大的一种物质，汽车尾气、塑料燃烧的烟气、油漆以及爆米花、皮蛋等食品中都含有铅，通过人体呼吸、消化系统甚至皮肤而直接进入人体，进而对人体的诸多器官带来危害，可引起铅脑病、多发性神经炎和溶血性贫血等疾病，严重者甚至导致瘫痪。(1)土壤铅污染：土壤中的铅残留主要来自天然存储和人类活动两方面。自然来源主要指矿物资源。人为来源主要是大气沉降、工业固废。人类活动向大气中排放的汞、铅等重金属的最后归宿是海洋和土壤；工业固废主要产生于金属加工、化工制品等。此外，在耕种土地上无科学方法指导的过度使用各类化学药品，也加重了土壤的铅污染。(2)水体铅污染：水体中的铅也主要来自天然存储和人类活动两个方面。前者主要来自岩石矿物流出、火山爆发释放等，后者才是水体中铅污染的主要来源。此外，采矿废水、含铅废液的直接排放等人类生产活动直接将铅污染带入了水体。铅污染现象愈发严重、铅中毒事件频繁发生，虽然近年来人们对铅中毒事件的警觉性得以提高，大规模、高剂量的中毒事件鲜有发生，但小规模、低剂量的中毒事件未能避免，人们急需找到一种高效快速的铅离子检测方法，各种科学技术发展至今，关于铅离子的检测方法主要可分为物理法、化学法和生物法三大类。物理法研究中对铅离子的检测主要包括原子吸收分光光度计法、原子荧光光度法和电感耦合等离子体质谱法。这些传统的物理分析方法虽然具备高精准度、低检测限，但是均需要昂贵的仪器设备和专业操作人员，因此阻碍了大规模的推广使用。化学法作为传统的检测方法，主要包括滴定法、极普法、化学发光法、双硫脲比色法，这些方法通常存在灵敏度低、特异性差等缺点，而且检测中容易对环境造成二次污染，也不适用于重金属的实时快速检测。生物法主要包括酶传感器、DNA传感器和微生物传感器等，生物传感器法具有成本低廉、操作简单、耗时短等优势，同时还兼具灵敏度高、特异性强、响应迅速的优点，尤其是全细胞水平金属探针，其灵敏度和稳定性比其他金属型生物传感器更为优越。全细胞微生物传感器(Whole-cellbiosensor)是一种便捷、快速、低成本的环境重金属检测工具，它采用基因工程技术对活体微生物进行改造，使其能够对重金属污染物进行定量分析，主要包括检测元件和报告元件，检测元件是能够响应目标物质的部分，报告元件一般选择一种便于检测的蛋白，如荧光蛋白，包括绿色荧光蛋白GFP、黄色荧光蛋白TFP等，或荧光素等。当环境中存在重金属离子，重组质粒中的转录调控蛋白被重金属离子特异性激活，与特异性启动子绑定或者脱落，激活或者抑制启动子的启动，进而调控下游报告元件的表达量的变化，产生可检测的信号，并且信号强度与环境中存在的重金属的浓度密切相关。转录调控蛋白对重金属的绑定与识别能力是生物传感器的检测限的关键，同时报告元件的信号输出能力决定着微生物传感器的灵敏度。全细胞生物传感器已成为重金属检测的重要工具，同时对于重金属污染修复提供有效帮助。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过对铅离子生物传感器进行设计，提供一种对铅离子敏感的具有基因级联放大表达系统的全细胞生物传感器。同时提出对铅离子敏感的具有基因级联放大表达系统的全细胞生物传感器的构建方法；它克服原有生物传感器灵敏度低、检测限高的不足。同时本专利技术还提供一种对铅离子敏感的全细胞生物传感器通过荧光检测对铅离子浓度进行测定的方法。本专利技术的技术方案概述如下：提出一种对铅离子敏感的具有基因级联放大表达系统的全细胞生物传感器。本专利技术的对铅离子敏感的具有基因级联放大表达系统的全细胞生物传感器的构建方法；包括如下步骤：(1)将人工全合成双向启动子Ppbr以及铅离子特异性结合蛋白PbrR如SEQIDNo.1所示核苷酸序列与质粒pGN68所含自反馈调控蛋白LuxR的SEQIDNo.4的核苷酸序列通过酶切方式连接，筛选阳性克隆得到目标重组载体pET28a-pbr-lux(附图1)；质粒pGN68含有自反馈启动子PluxRI其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示、绿色荧光蛋白基因核苷酸序列如SEQIDNo.2所示、自反馈调控蛋白LuxR核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，按照酶切方式依次连接；(2)利用大肠杆菌E.coliDH5α作为宿主，将重组载体pET28a-pbr-lux以及质粒pGN68共转化，得到对铅离子敏感性的全细胞生物传感器(见图2)。根据反应机理：铅离子存在时，pbrR蛋白与铅离子结合导致其蛋白结构发生改变，从铅操纵子上脱落，启动下游荧光基因的表达，从而建立铅离子与荧光蛋白表达量之间的关系(附图3)。利用本专利技术的传感器对铅离子的检测方法，以E.coliDH5α为宿主菌，通过生物传感器细胞的生长情况(附图4)以及荧光强度与铅离子浓度的关系制作标准曲线(附图5)，从而对环境中的铅离子进行定量。具体说明如下：1.对铅离子敏感的全细胞生物传感器的搭建方法，包括如下步骤：(1)人工全合成双向启动子Ppbr以及铅离子特异性结合蛋白PbrR，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；质粒pGN68所含绿色荧光蛋白基因GFP，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；质粒pGN68所含自反馈启动子PluxRI，其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；质粒pGN68所含自反馈调控蛋白LuxR，其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；(2)将SEQIDNo.1所示核苷酸序列和SEQIDNo.4所示核苷酸序列通过酶切方式连接，筛选阳性克隆得到目标重组载体pET28a-pbr-lux；质粒pGN68含有自反馈启动子PluxRI其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示、SEQIDNo.2所示绿色荧光蛋白基因核苷酸序列、SEQIDNo.4所示自反馈调控蛋白LuxR核苷酸序列按照酶切方式依次连接。(3)利用大肠杆菌E.coliDH5α作为宿主，将重组载体pET28a-pbr-lux以及质粒pGN68共转化，得到对铅离子敏感性的目标重组菌株。2.铅离子敏感的全细胞生物传感器的检测方法，包括以下步骤：(1)对铅离子敏感的全细胞生物传感器的底盘细胞进行培养第一步进行试管种子液培养：将重组菌E.coliDH5α按照0.5％接种量接种在LB培养基于试管中，37℃，220rpm，过夜培养12-14h，得到种子培养液。第二步进行摇瓶发酵培养：取种子培养液按照1％接种量，转接到含有100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，220rpm、37℃，定时取样检测。(2)对铅离子敏感的全细胞生物传感器的荧光检测取1mL菌液于干净的比色皿中，于紫外分光光度计中测定吸光度，并置于荧光分光光度计内进行测量，测量条件为：激发波长480nm，发射波长520nm。本专利技术的优点：本专利技术构建的对铅离子敏感的全细胞生物传感器，以E.coliDH5α为宿主菌，通过荧光强度于铅离子浓度的关系制作标准曲线，从而对环境中的铅离子进行定量。本专利技术可降低铅离子生物传感器检测背景值，同时提高铅离子生物传感器的敏感度，放大荧光信号，对环境中的铅离子进行定量检测。附图说明图1是全细胞生物传感器的重组载体pET28a-pbr-lux本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对铅离子敏感的具有基因级联放大表达系统的全细胞生物传感器。

【技术特征摘要】
1.一种对铅离子敏感的具有基因级联放大表达系统的全细胞生物传感器。2.权利要求1对铅离子敏感的具有基因级联放大表达系统的全细胞生物传感器的构建方法；包括如下步骤：(1)将人工全合成双向启动子Ppbr以及铅离子特异性结合蛋白PbrR如SEQIDNo.1所示核苷酸序列与质粒pGN68所含自反馈调控蛋白LuxR的SEQIDNo.4的核苷酸序列通过酶切方式连接，筛选阳性克隆得到目标重组载体pET28a-pbr-lux；质粒pGN68含有自反馈启动子PluxRI其核苷酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾晓强，卜蓉蓉，刘一琳，吴康，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12