亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装方法及采用该方法制备的三棱柱的纳米制剂和应用技术

本发明专利技术涉及一种亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装方法及采用该方法制备的三棱柱的纳米制剂和应用，所述自组装方法是通过亚精胺三盐酸盐取代传统TAE‑Mg

Spermidine three hydrochloride mediated self-assembly method for nucleic acid nanomaterials and the three prism nano preparation prepared by this method and its application

The invention relates to a method for self-assembly of nanoscale nanomaterials mediated by spermidine three hydrochloride and a nanoscale preparation and application of three prism prepared by the method. The self-assembly method is to replace the traditional TAE Mg by subspermidine three hydrochloride.

【技术实现步骤摘要】
亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装方法及采用该方法制备的三棱柱的纳米制剂和应用
本专利技术涉及一种亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装的方法，特别涉及一种亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装方法及采用该方法制备的携带siRNA的三棱柱的纳米制剂和应用。
技术介绍
开发通用的药物载体是纳米医学最重要的研究主题。过往的已经开发了多种药物递送载体，例如：环糊精材料，阳离子脂质体，病毒衣壳，高分子聚合物材料等，但是这些往往都是的物质，存在免疫原性以及一些潜在的毒性，因此并不能很好地投入医学实用。面对上述问题，近来在新兴的DNA纳米技术提供了很好的解决方法，DNA是人体内的天然组分，短链DNA不存在免疫原性以及潜在毒性，且容易被生物降解，与此同时根据其碱基互补配对的原则，DNA纳米材料可以实现很好的可编程性，可能存在潜在的实现靶向性治疗，因此自组装的DNA纳米材料在疾病的基因治疗领域存在巨大的潜力。随着技术的发展，将DNA纳米材料用于疾病的基因治疗又面临着一些新的挑战，传统的方式是镁离子介导DNA纳米材料的合成，往往合成需要很复杂的退火过程，且维持纳米材料稳定性的体系与生理条件存在很大的差异。同时由于传统的合成体系需要较高浓度的盐溶液体系，高的镁离子浓度对酶的活性有伤害。DNA纳米材料自身带有高负电性，细胞对于材料的摄取效率往往也是不够理想的，一定程度上限制了自组装核酸纳米材料的应用.因此上述问题都亟待解决。亚精胺是一种内源性多胺类物质。内源性多胺类物质是一种天然的DNA缩合剂。亚精胺三盐酸盐易溶于水，在水中带正电荷，同时再低剂量下并不存在细胞毒性。在生理条件下，生物体中的多胺类物质如腐胺、亚精胺、精胺是线性的、质子化的高价离子化合物，因而可以通过静电相互作用与负电性的DNA或RNA相互作用。多胺类物质作为DNA的体外缩合剂已被大量研究。其本身由于质子化的多胺中和了核酸的负电性。因此，可以作为一种天然的阳离子化合物来替代镁离子来中和DNA之间的负电性，从而来介导DNA纳米材料的自组装。亚精胺三盐酸盐介导的DNA自组装纳米材料通过结构的位阻效应提高材料在生理条件下的稳定性，其次亚精胺三盐酸盐介导的DNA自组装纳米材料无需额外的纳米递送系统，其本身由于质子化的多胺中和了核酸的负电性，更易为细胞所摄取。肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，对于肺癌的治疗一直都是全世界关注的焦点，以前的研究表明，控制肿瘤细胞的恶行增殖往往就可以控制肺癌的进一步发展，从而达到治疗的效果。哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)，一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞应对生理条件及环境压力时调控自噬及生长的关键成分。哺乳动物雷帕霉素蛋白已被证实与肿瘤的发生、发展，心血管疾病，自身免疫性疾病，代谢性疾病等多种疾病密切相关。因此，将哺乳动物雷帕霉素蛋白作为靶标可以用来做关于多种疾病的基因治疗。研究表明哺乳动物雷帕霉素蛋白激活可以导致肿瘤细胞的大量增殖，相应的若我们抑制其激活，可以抑制肿瘤细胞的生长。小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，可高效、特异地抑制靶基因翻译过程，实现靶基因的表达下调。因此，如何设计开发临床适用的针对肺癌治疗的siRNA递送系统仍然具有巨大的挑战。基于上述原因，我们专利技术了一种通过亚精胺三盐酸盐，并使用三种不同的控制时间和温度的方式(包括：梯度退火，恒温自组装以及慢退火)来介导核酸纳米材料的自组装。我们又设计了一种新型的DNA三棱柱纳米材料，应用我们专利技术的制备方法，并将功能基因mTORsiRNA由特定的摩尔比，通过碱基互补配对到纳米三棱柱结构上形成新型的纳米复合体制剂。我们专利技术的这种新型纳米材料，不但保留了传统核算纳米材料所有的，可编程性，良好的生物相容性以及生物稳定性等特点，而且在生理条件下的体系中有着良好的稳定性，更好的血清稳定性，并能更好的被细胞摄取，从而可以释放更多交联系统中的siRNA，使其更好地发挥生物学效应。基于亚精胺三盐酸盐介导核酸自组装纳米载体的多种优势，其在基因研究和治疗中具有巨大的潜力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装的方法及采用该方法制备的携带siRNA的三棱柱的纳米制剂和应用，该方法可以在恒温下、梯度退火以及慢退火实现自组装，肺癌细胞对其的摄取效率显著提高，制备成的核酸纳米材料较传统可以更稳定的存在于生理体系下，并且在血清中可以稳定存在更久，同时该制剂能有效抑制肺癌细胞的增殖。本专利技术的技术方案是：一种亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装的方法，其特征在于，有方法如下：1)取需合成纳米材料的DNA冻干粉，分别加H2O稀释，混匀，得到DNA溶液；2)取DNA溶液均按需要组装核酸的数量设置摩尔比(根据不同DNA纳米材料的结构，设计DNA链的摩尔比)，在亚精胺三盐酸盐水溶液中恒温下、梯度退火以及慢退火介导核酸纳米材料的自组装合成。步骤2)所述的恒温为37℃或45℃。步骤2)所述恒温合成为，恒温下放置30～90min，将DNA溶液混合，再在恒温下放置30～90min。步骤2)所述梯度退火合成为，95℃放置5min，65℃放置30min，50℃放置30min，37℃放置30min，22℃放置30min，将DNA溶液混合，37℃放置60min，然后在22℃放置60min。步骤2)所述慢退火合成为，密封DNA溶液，放入100℃的水中缓慢降温，两天降至室温。步骤2)所述亚精胺三盐酸盐水溶液的pH值为6.0-10.0。步骤2)所述亚精胺三盐酸盐水溶液的介导核酸纳米材料自组装的浓度范围50μM-300μM。采用上述方法制备的携带siRNA的三棱柱的纳米制剂，所述的纳米材料由序列如SEQIDNO：2所示的P1、序列如SEQIDNO：3所示的P2、序列如SEQIDNO：4所示的P2’，通过单链分子碱基互补配对合成。所述的P1、P2、P2’的摩尔比2:3:3，mTORsiRNA、P1、P2、P2’的摩尔比为6:2:3:3，。携带siRNA的三棱柱的纳米制剂的制备方法，有以下步骤：1)取P1、P2、P2’的冻干干粉，分别加H2O稀释，混匀，得到P1、P2、P2’溶液；2)取P1、P2与P1、P2’溶液均按照1：3的比例在亚精胺三盐酸盐水溶液中分别化合，DNA三棱柱在恒温下或梯度退火或慢退火合成，得到P1、P2、P2’的摩尔比为2:3:3的纳米材料溶液，将mTORsiRNA添加到纳米材料溶液中，再次放置30min，得到mTORsiRNA、P1、P2、P2’的摩尔比的纳米制剂溶液。步骤2)所述的亚精胺三盐酸盐溶液的pH值分别为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。携带siRNA的三棱柱的纳米制剂在制备治疗肺癌的药物中的应用。携带siRNA的三棱柱的纳米制剂分子量为149，679.5。与传统方法制备而成的核酸纳米材料相比较，亚精胺三盐酸盐介导的纳米材料自组装具有以下优点：1)可以在恒温下介导核酸纳米材料的自组装，从而使得合成方法更加简单。2)其可以在不借助转染剂的辅助，使得细胞有所摄取，并且细胞摄取率与转染剂辅助传统镁离子介导自组装核酸纳米材料的摄取率相当。3)亚精胺三盐酸盐本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装的方法，其特征在于，有方法如下：1)取需合成纳米材料的DNA冻干粉，分别加H2O稀释，混匀，得到DNA溶液；2)取DNA溶液均按需要组装核酸的数量设置摩尔比，在亚精胺三盐酸盐水溶液中恒温下、梯度退火以及慢退火介导核酸纳米材料的自组装合成。

【技术特征摘要】
1.一种亚精胺三盐酸盐介导核酸纳米材料自组装的方法，其特征在于，有方法如下：1)取需合成纳米材料的DNA冻干粉，分别加H2O稀释，混匀，得到DNA溶液；2)取DNA溶液均按需要组装核酸的数量设置摩尔比，在亚精胺三盐酸盐水溶液中恒温下、梯度退火以及慢退火介导核酸纳米材料的自组装合成。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述的恒温为37℃或45℃。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述恒温合成为，恒温下放置30～90min，将DNA溶液混合，再在恒温下放置30～90min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述梯度退火合成为，95℃放置5min，65℃放置30min，50℃放置30min，37℃放置30min，22℃放置30min，将DNA溶液混合，37℃放置60min，然后在22℃放置60min。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述慢退火合成为，密封DNA溶液，放入100℃的水中缓慢降温，两天降至室温。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述亚精胺三盐酸盐水溶液的pH值为6.0-10.0。7.根据权利要求1所述方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱航，王栋，王关嵩，刘倩，贺斌峰，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50