一种基因甲基化的检测方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因甲基化的检测方法。本发明专利技术检测方法是采用限制性内切酶处理待检测核酸，并针对待检区域核酸序列设计特异性的引物探针，进行PCR扩增和荧光信号检测。本发明专利技术具有操作简单，特异性强，灵敏度高的优势。

【技术实现步骤摘要】
一种基因甲基化的检测方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种基因甲基化的检测方法。
技术介绍
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。因此，研究基因的甲基化对癌症的早期筛查具有非常重要的意义。目前，基因甲基化的检测主要是通过亚硫酸氢盐处理，再以甲基化特异性的PCR或测序的方法进行区分，该类方法容易发生亚硫酸氢盐转化不完全而导致的假阳性结果，且操作步骤繁琐，所需试剂种类多，耗时长。
技术实现思路
针对现技术存在的问题，本专利技术提供一种基因甲基化的检测方法，目的是通过采用限制性内切酶结合实时荧光定量PCR，实现操作简单、特异性强、灵敏度高的基因甲基化检测。实现本专利技术目的的基因甲基化检测方法按照以下步骤进行：(1)采用限制性内切酶反应液中的限制性内切酶处理待测样本核酸DNA，得到酶切产物；(2)向检测引物探针中加入酶切产物，形成的qPCR反应液，进行qPCR扩增；(3)根据qPCR结果进行FAN荧光通道检测，若被检样本FAM荧光通道有扩增，则为阳性样本，说明目的基因发生甲基化，若FAM荧光通道没有扩增，则为阴性样本，说明目的基因没有甲基化。其中，所述的待测样本包括：人类的全血样本、血浆样本、FFPE样本、唾液样本、尿液样本、粪便样本以及植物和微生物。所述的限制性内切酶反应液，具体组分包括：10-100U限制性内切酶，5μL10×限制性内切酶酶切缓冲液。所述的限制性内切酶为第二型限制性内切酶中的一种或两种以上，根据目的基因进行选择，具体包括：AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BspEI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、BtgZI、ClaI、EagI、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NaeI、NarI、NgoMIV、NotI、NruI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PluTI、PmlI、PvuI、RsrII、SacII、SalI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TliI、TspMI、XhoI、XmaI、ZraI。所述的处理处理待测样本核酸DNA时间为1～16小时。所述的检测引物探针包括：目的基因引物对和探针；内参基因引物对和探针。所述的qPCR反应液，具体组分包括：0.1-1μM目的基因引物对，0.1-1μM目的基因探针，0.1-1μM内参基因引物对，0.1-1μM内参基因探针，2×qPCRMasterMix。所述的qPCR平台包括：Roche、ABI、Bio-Rad、Agilent、杭州博日科技有限公司(BIOER)。所述的FAN荧光通道检测的检测限为：样本DNA含量≥2ng、甲基化突变频率低≥1％与现有技术相比，本专利技术的特点和有益效果是：本专利技术检测方法为限制性内切酶处理待检测核酸，甲基化核酸序列为限制性酶识别区域，限制性内切酶对甲基化的核酸序列识别但不酶切，而对非甲基化核酸序列识别并发生酶切活性。因此，甲基化的核酸序列保留完整，而非甲基化核酸序列被酶切成小片段。基于上述原理，本专利技术针对待检区域核酸序列设计特异性的引物探针，若待测区域内发现甲基化修饰，则未被酶切能与特异性引物探针结合，产生荧光信号；若待测区域内未发生甲基化修饰，则酶切成小片段而特异性引物探针不能结合，不产生荧光信号。本专利技术具有操作简单，特异性强，灵敏度高的优势。附图说明图1是本专利技术实施例1中3例正常人和2例结直肠癌血浆样本Septin9基因甲基化检测图；图2是本专利技术实施例2中样本a1，a2，a3，a4，a5，a6的FAM通道扩增图；图3是本专利技术实施例2中样本a1，a2，a3，a4，a5，a6的Cy5通道扩增图；图4是本专利技术实施例2中样本b1，b2，b3，b4，b5，b6的FAM通道扩增图；图5是本专利技术实施例2中样本b1，b2，b3，b4，b5，b6的Cy5通道扩增图。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1：本实施例对目的基因Septin9基因进行甲基化检测，涉及的材料有：待测血浆样本、使用甲基化和非甲基化标准品DNA(HumanMethylated&Non-MethylatedDNASet，Catalog#D5014，ZYMORESEARCH)进行掺和，甲基化DNA比例分别为1％和0％，浓度均为2ng/μL。仪器：RocheLightcycler480II实时荧光定量PCR仪、普通PCR仪、螺旋混匀仪、水浴锅、涡旋振荡仪。具体按照以下步骤进行：(1)本实施例中待测样本为正常人血浆或结直肠癌患者血浆，采用试剂盒(TheMagMAXTMCell-FreeDNAIsolationKit)提取待测样本DNA，具体的操作参见试剂盒产品说明书；获得样本DNA后，使用Qubit3.0测量浓度，合格的样本DNA溶液即为样本A，-20℃保存；根据Septin9基因甲基化区域序列特点，选择特异性的甲基化限制性内切酶AciI，采用AciI反应液中的AciI处理待测样本A，酶切量为10U，酶切时间为2h，得到酶切后的产物B；(2)向检测引物探针中加入酶切产物，形成的qPCR反应液，进行qPCR扩增；所述的引物的纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，不含杂带；Septin9基因探针5’端报告荧光基团为FAM,3’端的淬灭基团为BHQ1；GADPH基因探针5’端报告荧光基团为Cy5,3’端的淬灭基团为BHQ1；所有引物和探针由本专利技术研发人员自主设计，然后由供应商提供；本实施例中目的Septin9基因的引物探针：上游引物：5'-GCTGGATGGGATCATTTCGGA-3'下游引物：5'-GGTCCTCTCCAGCACGTC-3'探针：5'-FAM-CATCATGTCGGACCCCGCGGTCAACG-Q-3'内参基因GADPH基因引物探针：上游引物：5'-CCTGCCGGTGACTAACCC-3'下游引物：5'-GCCACACGCGACTCCAC-3'探针：5'-Cy5-TGCGCTCCTGCCTCGATGGGTGGAGTCGCG-Q-3'；本实施例的qPCR扩增体系如表1所示：表1成分体积Septin9上游引物(10μM)1μLSeptin9下游引物(10μM)1μLSeptin9探针(10μM)0.5μLGAPDH上游引物(10μM)1μLGAPDH下游引物(10μM)1μLGAPDH探针(10μM)0.5μL2xqPCRMasterMix25μL酶切产物B10μLddH2O补水至50μL指尖轻弹反应管，瞬时离心，置于Lightcycler480II上进行qPCR检测，反应程序如表2所示：表2(3)结果判定：为了监测酶切体系，以2ng的Se本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因甲基化检测方法，其特征在于按照以下步骤进行：(1)采用限制性内切酶反应液中的限制性内切酶处理待测样本核酸DNA，得到酶切产物；(2)向检测引物探针中加入酶切产物，形成的qPCR反应液，进行qPCR扩增；(3)根据qPCR结果进行FAN荧光通道检测，若被检样本FAM荧光通道有扩增，则为阳性样本，说明目的基因发生甲基化，若FAM荧光通道没有扩增，则为阴性样本，说明目的基因没有甲基化。

【技术特征摘要】
1.一种基因甲基化检测方法，其特征在于按照以下步骤进行：(1)采用限制性内切酶反应液中的限制性内切酶处理待测样本核酸DNA，得到酶切产物；(2)向检测引物探针中加入酶切产物，形成的qPCR反应液，进行qPCR扩增；(3)根据qPCR结果进行FAN荧光通道检测，若被检样本FAM荧光通道有扩增，则为阳性样本，说明目的基因发生甲基化，若FAM荧光通道没有扩增，则为阴性样本，说明目的基因没有甲基化。2.根据权利要求1所述的一种基因甲基化检测方法，其特征在于所述的待测样本包括：人类的全血样本、血浆样本、FFPE样本、唾液样本、尿液样本、粪便样本以及植物和微生物。3.根据权利要求1所述的一种基因甲基化检测方法，其特征在于所述的限制性内切酶反应液，具体组分包括：10-100U限制性内切酶，5μL10×限制性内切酶酶切缓冲液。4.根据权利要求1所述的一种基因甲基化检测方法，其特征在于所述的限制性内切酶为第二型限制性内切酶中的一种或两种以上，根据目的基因进行选择，具体包括：AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BspEI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、BtgZI、ClaI、EagI、FauI、FseI、FspI...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦闯华，陆利，徐根明，潘艺，赵谦，
申请(专利权)人：湖南大地同年生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43