基于KASP技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心SNP标记及其应用制造技术

本发明专利技术涉及甘蓝品种鉴定，具体涉及一组基于KASP技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心SNP标记及其应用。所述核心SNP标记包含Bol01～Bol50 SNP标记中的任意一种或更多种，或全部；所述Bol01～Bol50 SNP标记的具体信息如表1所示。基于所述核心SNP标记，可实现对甘蓝杂交种的高通量SNP分型检测，结果准确性高，稳定性好，能够显著提高品种鉴定效率。

【技术实现步骤摘要】
基于KASP技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心SNP标记及其应用
本专利技术涉及甘蓝品种鉴定，具体涉及一组基于KASP技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心SNP标记及其应用。
技术介绍
结球甘蓝简称甘蓝，是十字花科芸薹属的一种重要蔬菜，在我国各地广泛种植。截止至2015年，我国审(鉴、认)定或登记的甘蓝品种共计247个，其中大部分为一代杂种。近年来，市场上的甘蓝品种不断增多，种植面积不断增大。但是，在市场上同名异物及同物异名的情况时有发生，甚至一些不合格种子混入市场带来巨大的经济损失，因此对品种进行快速准确鉴定对于假种辨别和解决产权纠纷具有重要作用。现行的植物新品种特异性、一致性和稳定性(DUS)测试主要依据行业标准考察品种的表型，但存在鉴定周期长、易受环境影响、测试性状多等问题，给品种权纠纷、司法维权带来困难。随着分子生物学的发展，分子标记技术的出现为品种鉴定提供了新的手段。分子标记技术具有周期短、不受环境影响、可进行高通量测试分析等优点，已经在品种鉴定、种子纯度鉴定等方面得到广泛应用。国际植物新品种保护联盟(UPOV)于2010年发布了DNA分子标记选择和数据库构建指南(简称BMT指南)，指出SSR和SNP标记是特别适用于品种鉴定的方法。SSR标记具有多态性高、共显性、实验程序简单、结果重复性好等优点，在甘蓝品种鉴定中得到广泛的应用。但利用SSR标记进行品种鉴定存在着SSR标记数量有限、检测位点少，SSR位点存在一定的突变率、对变异反应比较敏感等缺点，而利用SNP标记构建的指纹库则能克服这些问题。相对于传统的SSR标记，SNP标记具有数量多、分布广泛、稳定性高、易于快速且高通量分型的特点。常用的SNP检测方法有基于DNA芯片技术、测序及竞争性等位基因特异性PCR等。DNA芯片技术是检测SNP的最常用方法，但该方法的成本较高。KASP(KompetitiveAlleleSpecificPCR，即竞争性等位基因特异性PCR)技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP进行分型，该技术具有高度的稳定性与准确性，其检测原理是：针对每个SNP位点设计两条3’端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物，两条正向引物5’端分别连有序列不同的F标签和H标签，三种引物组成PrimerMix；设计荧光探针，F探针与F标签序列一致，H探针与H标签序列一致，F探针的5’端有一个FAM荧光基团，H探针的5’端有一个HEX荧光基团，相应于F探针和H探针，各设计一个3'端带淬灭基团的淬灭探针，构成荧光引物；将DNA模板、PrimerMix、含有荧光引物的MasterMix混合后进行PCR；PCR反应1：变性模板与PrimerMix中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了标签序列；PCR反应2：等位基因特异性的末端序列的互补链合成；PCR反应3：特异序列对应的标签随PCR反应进行指数性增长，相应信号被检测。相比于DNA芯片技术，利用KASP技术进行SNP检测的成本较低，其成本与检测的SNP位点数呈正相关。因此，基于KASP技术开发SNP标记进行品种鉴定，可大大提高鉴定效率。
技术实现思路
为满足上述领域的需求，本专利技术提供一组基于KASP技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心SNP标记，基于所述核心SNP标记，可实现对甘蓝杂交种的高通量SNP分型检测。本专利技术基于KASP技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心SNP标记，其特征在于，包含Bol01～Bol50SNP标记中的任意一种或更多种，或全部；所述Bol01～Bol50SNP标记的具体信息如表1所示：表1.用于甘蓝杂交种鉴定的核心SNP标记所述SNP物理位置是基于甘蓝自交系02-12的全基因组序列而确定的，所述甘蓝自交系02-12的全基因组序列在NCBI数据库中的序列号为KR233156。本专利技术开发的核心SNP标记，均匀分布于甘蓝基因组的9条染色体上，每条染色体上各5-6个SNP标记，共50个SNP标记。基于这套核心SNP标记，可实现对甘蓝杂交种的高通量SNP分型检测，结果准确性高，稳定性好，能够显著提高品种鉴定效率。本专利技术还提供用于扩增所述核心SNP标记的引物组合，其特征在于，包含Bol01p～Bol50p引物组中的任意一组或更多组，或全部；所述Bol01p～Bol50p引物组的序列信息如表2所示：表2.用于PCR扩增核心SNP标记的引物组优选地，所述引物组合包含：选自Bol01p～Bol05p引物组中的至少1组，用于检测染色体C01上对应的SNP标记；选自Bol06p～Bol10p引物组中的至少1组，用于检测染色体C02上对应的SNP标记；选自Bol11p～Bol16p引物组中的至少1组，用于检测染色体C03上对应的SNP标记；选自Bol17p～Bol22p引物组中的至少1组，用于检测染色体C04上对应的SNP标记；选自Bol23p～Bol27p引物组中的至少1组，用于检测染色体C05上对应的SNP标记；选自Bol28p～Bol33p引物组中的至少1组，用于检测染色体C06上对应的SNP标记；选自Bol34p～Bol39p引物组中的至少1组，用于检测染色体C07上对应的SNP标记；选自Bol40p～Bol45p引物组中的至少1组，用于检测染色体C08上对应的SNP标记；和选自Bol46p～Bol50p引物组中的至少1组，用于检测染色体C09上对应的SNP标记。本专利技术还提供用于鉴定或辅助鉴定甘蓝杂交种的试剂盒，其特征在于，包含粉末状的或液态的所述引物组合。优选地，每一组引物中的两条正向引物的5’端分别带有序列标签A和序列标签B，所述序列标签A和序列标签B的核苷酸序列互不相同并且与甘蓝基因组序列不同源。根据该原理，本领域技术人员可以获得若干适合的序列标签。优选地，还包含PCR预混液，所述PCR预混液含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；所述荧光探针A的核苷酸序列与序列标签A的核苷酸序列一致，其5’端连接荧光基团A；所述淬灭探针A的核苷酸序列与序列标签A的核苷酸序列反向互补，其3’端连接淬灭基团；所述荧光探针B的核苷酸序列与序列标签B的核苷酸序列一致，其5’端连接荧光基团B；所述淬灭探针B的核苷酸序列与序列标签B的核苷酸序列反向互补，其3’端连接淬灭基团；所述PCR预混液还包含ROX内参染料，KlearTaqDNA聚合酶，dNTP和MgCl2。本专利技术还提供所述核心SNP标记或所述引物组合或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定甘蓝杂交种中的应用。根据实际需要，可以选择50个SNP标记中的9个或更多个或全部进行基因型检测。在一些实施例中，通过检测其中1个SNP标记来确定待测甘蓝品种是否属于目标品种或者甘蓝杂交品种的纯度。在另一些实施例中，检测其中9个或9个以上的SNP标记来确定待测甘蓝品种是否属于目标品种或者甘蓝杂交品种的纯度。优选地，从C01～C09的每个染色体上选择至少一个SNP标记进行检测。更优选地，检测全部50个SNP标记来鉴定待测甘蓝品种。本专利技术还提供一种用于鉴定或辅助鉴定甘蓝杂交种的方法，其特征在于，对待测甘蓝品种进行SNP分型检测，包括以下步骤：(1)提取待测甘蓝品种的DNA；(2)以所述引物组合中的每一组引物分别对待测甘蓝品种的DNA进行PCR扩增；(3)检查扩增结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于KASP技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心SNP标记，其特征在于，包含Bol01～Bol50SNP标记中的任意一种或更多种，或全部；所述Bol01～Bol50SNP标记的具体信息如下：

【技术特征摘要】
1.基于KASP技术开发的用于甘蓝杂交种鉴定的核心SNP标记，其特征在于，包含Bol01～Bol50SNP标记中的任意一种或更多种，或全部；所述Bol01～Bol50SNP标记的具体信息如下：编号染色体SNP物理位置等位基因编号染色体SNP物理位置等位基因Bol01C014798641T/CBol26C0519285540T/CBol02C0110421763T/CBol27C0527307916G/TBol03C0117385144C/TBol28C061518700A/CBol04C0131515139T/CBol29C068365364T/ABol05C0137692928G/ABol30C0614958187T/CBol06C0211914925A/CBol31C0625031015T/CBol07C0214119719T/GBol32C0631431471C/TBol08C0229630462C/TBol33C0638213660A/TBol09C0238362631G/ABol34C073897328C/GBol10C0242140571G/CBol35C0718794441A/GBol11C03572949T/CBol36C0727199113G/TBol12C0310349815T/ABol37C0733905766A/GBol13C0319333749C/TBol38C0738826795A/-Bol14C0332861302G/CBol39C0746200440T/CBol15C0340497522C/TBol40C081046990T/ABol16C0350577875G/TBol41C0817295300T/CBol17C042284389G/CBol42C0827133960G/ABol18C049227821C/TBol43C0834047383C/TBol19C0414041102C/TBol44C0837116007A/GBol20C0423412413C/ABol45C0839508393T/GBol21C0430318761C/GBol46C09732156T/GBol22C0437907183C/ABol47C098645093T/ABol23C05179080T/CBol48C0929633956T/ABol24C0513597610A/GBol49C0934784844T/CBol25C0515649112T/ABol50C0937947752G/T所述SNP物理位置是基于甘蓝自交系02-12的全基因组序列而确定的，所述甘蓝自交系02-12的全基因组序列在NCBI数据库中的序列号为KR233156。2.用于扩增权利要求1所述核心SNP标记的引物组合，其特征在于，包含Bol01p～Bol50p引物组中的任意一组或更多组，或全部；所述Bol01p～Bol50p引物组的序列信息如下：3.根据权利要求2所述的引物组合，其特征在于，包含：选自Bol01p～Bol05p引物组中的至少1组，用于检测染色体C01上对应的SNP标记；选自Bol06p～Bol10p引物组中的至少1组，用于检测染色体C02上对应的SNP标记；选自Bol11p～Bol16p引物组中的至少1组，用于检测染色体C03上对应的SNP标记；选自Bol17p～Bol22p引物组中的至少1组，用于检测染色体C04上对应的SNP标记；选自Bol23p～Bol27p引物组中的至少1组，用于检测染色体C05上对应的SN...

【专利技术属性】
技术研发人员：张扬勇，李志远，方智远，杨丽梅，庄木，吕红豪，王勇，刘玉梅，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11