人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用技术

本发明专利技术提供了人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用，属于医药技术领域。本发明专利技术用无血清培养基培养人脐带间质干细胞，收集上清液，经过离心和超滤浓缩，得到浓缩液移至30％蔗糖重水密度垫上采用蔗糖密度离心进一步纯化，得到人脐带间质干细胞外泌体。本发明专利技术通过分离纯化得到人脐带间质干细胞外泌体有效降低免疫反应性，使用时保证剂量可控。所述人脐带间质干细胞外泌体通过提高二型糖尿病动物模型胰岛素信号通路的活化程度，抑制肝糖原合成分解，从而实现葡萄糖代谢稳态的调节，同时提高二型糖尿病动物模型对胰岛素的敏感性及胰岛β细胞的胰岛素分泌功能降低血糖浓度，实现制备治疗二型糖尿病的药物的应用。

【技术实现步骤摘要】
人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用
本专利技术属于医药
，具体涉及人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用。
技术介绍
糖尿病(diabetesmellitus)是一种由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的代谢性疾病。过去30多年，国内糖尿病的发病率由低于1％增长至超过10％，糖尿病患者人数已超过1亿，居全球第一，且不断趋于年轻化。糖尿病已成为我国严重的公共卫生问题。90％～95％的糖尿病患者为2型糖尿病(T2DM)，2型糖尿病患者早期通过控制饮食、增强运动及口服降糖药调节血糖，随着病情的发展，大多数患者需要长期依赖外源性胰岛素才能使血糖保持在正常范围，降糖药和胰岛素都存在大量不良反应如胃肠道应激、骨质疏松、低血糖、胰岛素注射部位皮下结节以及β细胞反馈性分泌功能丧失等，对于病情的控制及并发症的预防都存在不足，因此，亟需寻找降低糖尿病患者血糖，减轻治疗副作用并延缓糖尿病病情发展的新方法。国内外诸多研究表明，间质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)在血糖调节和胰岛细胞功能修复方面具有重要的作用，MSC能提高外周组织对胰岛素的敏感性，使组织对血液中葡萄糖的利用增加，在糖尿病的干预方面表现出了一定的效果，但MSC的应用标准、免疫反应性、潜在致瘤性及转基因技术的安全性等因素使MSC的在糖尿病治疗中的应用受到限制。目前MSC在糖尿病的治疗中存在较多毒副作用，仅用于控制病情对于病因没有实质性的改善；还存在伦理，剂量不可控及安全性问题。目前，外泌体与糖尿病的研究主要集中于疾病诊断，而用于糖尿病或糖代谢调控的仅有：WenD等发现过表达anti-miR-375的骨髓MSC来源外泌体携带anti-miR-375抑制胰岛移植的宿主免疫排斥反应(JControlledRelease,2016,238:166-175)；棕色脂肪组织来源的外泌体能够转运miR-99b至肝脏调控FGF-21表达(Nature,2017,542(7642):450)。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供人脐带间质干细胞外泌体(MSC-ex)的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用，分离纯化的人脐带间质干细胞外泌体对糖尿病的病因直接干预，具有安全性可控的特点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法，包括以下步骤：(1)将人脐带间质干细胞在无血清培养基上培养45～50h，收集培养上清液，离心，收集上层液，得到人脐带间质干细胞外泌体粗液；(2)将所述步骤(1)中人脐带间质干细胞外泌体粗液经超滤浓缩离心，得到浓缩液；所述超滤用超滤膜为100000Da规格；所述离心速度为1000～2000g；所述离心时间为15～20min；(3)将所述步骤(2)中的浓缩液移至质量浓度为30％的蔗糖重水密度垫上，在4℃条件下，80000～160000g密度梯度离心120min，收集底部缓冲垫；(4)将所述步骤(3)中底部缓冲垫经PBS溶液洗涤后置于100000DaMWCO超滤离心管中洗涤，收集浓缩液，得到人脐带间质干细胞外泌体。优选的，所述步骤(1)中培养的温度为36～38℃；所述培养时环境CO2的体积浓度为4％～6％。优选的，所述步骤(1)中离心的转速为1800～2000g；所述离心的时间为8～12min。优选的，所述步骤(4)中收集浓缩液后，还包括将所述浓缩液进行过滤除菌；所述过滤用滤膜的孔径为0.22μm。本专利技术提供了所述分离纯化方法得到的人脐带间质干细胞外泌体在制备降低二型糖尿病血糖含量药物中的应用。本专利技术提供了所述分离纯化方法得到的人脐带间质干细胞外泌体在制备提高二型糖尿病胰岛素分泌能力的药物中的应用。本专利技术提供了所述分离纯化方法得到的人脐带间质干细胞外泌体在制备提高二型糖尿病对胰岛素的敏感性的药物中的应用。本专利技术提供了所述分离纯化方法得到的人脐带间质干细胞外泌体在制备治疗二型糖尿病的药物中的应用。优选的，所述药物中人脐带间质干细胞外泌体的含量为8～12mg/kg.bw。优选的，所述药物的剂型为注射剂。本专利技术提供了人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法，用无血清培养基培养人脐带间质干细胞，使人脐带间质干细胞产生的外泌体溶于无血清培养基中，收集上清液，经过离心去除细胞碎片和细胞器，超滤浓缩后得到的浓缩液移至30％的蔗糖重水密度垫上采用蔗糖密度离心进一步纯化外泌体，经两次洗涤去除蔗糖残留物，得到人脐带间质干细胞外泌体。本专利技术提供的分离纯化方法操作简便，外泌体的蛋白纯度高，重复性好，适合工业化生产。本专利技术提供的分离纯化方法，所述人脐带间质干细胞外泌体的纯度达到90％～95％。同时通过本专利技术分离纯化得到人脐带间质干细胞外泌体有效降低免疫反应性，使用时保证剂量可控。此外，分离纯化得到人脐带间质干细胞外泌体使之易于保存，便于运输。本专利技术提供了所述分离纯化方法得到的人脐带间质干细胞外泌体在制备降低二型糖尿病血糖含量药物中的应用。所述人脐带间质干细胞外泌体能有效降低二型糖尿病动物模型血糖含量。实验证明，链脲佐菌素注射SD大鼠第七天时于尾静脉处注射人脐带间质干细胞外泌体(MSC-ex)，PBS为对照组，其后三天注射一次，共注射5次，检测餐后两小时血糖，与糖尿病组比较结果发现，随着人脐带间质干细胞外泌体的持续注射，小鼠血糖含量显著降低；口服糖耐糖实验表明，糖尿病组大鼠经注射人脐带间质干细胞外泌体后较糖尿病组大鼠的葡萄糖耐受能力显著提高，这表明人脐带间质干细胞外泌体能降低二型糖尿病动物模型血糖含量。本专利技术提供了所述分离纯化方法得到的人脐带间质干细胞外泌体在制备提高二型糖尿病胰岛素分泌能力药物中的应用。检测餐后血清胰岛素水平，糖尿病组大鼠经注射人脐带间质干细胞外泌体后餐后血清胰岛素水平较糖尿病组大鼠显著提高；胰岛素释放试验(IRT)表明，糖尿病组大鼠经注射人脐带间质干细胞外泌体后注射葡萄糖，与糖尿病组大鼠注射葡萄糖相比，前者胰岛素分泌的时相及水平显著优于后者。胰岛体积及数量检测等实验结果显示MSC-ex治疗的二型糖尿病大鼠胰岛体积及β细胞数量均高于未治疗组，提示MSC-ex提高了二型糖尿病大鼠胰岛素分泌水平。本专利技术提供了所述分离纯化方法得到的人脐带间质干细胞外泌体在制备提高对胰岛素的敏感性药物中的应用。用胰岛素耐受实验验证，以糖尿病组和正常组大鼠作为对照，其中糖尿病组大鼠注射胰岛素和葡萄糖，实验组为糖尿病组大鼠注射人脐带间质干细胞外泌体、胰岛素和葡萄糖，测定各组大鼠的血糖含量，结果发现，胰岛素注射后的30～120min内，糖尿病组大鼠血糖含量下降不明显，正常组和实验组大鼠血糖含量显著下降，这表明在人脐带间质干细胞外泌体的作用下，二型糖尿病动物模型对胰岛素降低血糖的敏感性提高，有利于降低动物模型内血糖含量。附图说明图1为MSC及其外泌体的鉴定，图1-A:脐带间质干细胞图；图1-B：脐带间质干细胞外泌体透射电镜图；图1-C：脐带间质干细胞外泌体表面标记图；图2为二型糖尿病大鼠模型鉴定，图2-A：正常组与糖尿病组餐前餐后血糖；图2-B：正常组与糖尿病组OGTT实验结果；图2-C：正常组与糖尿病组IPITT结果；图2-D：正常本文档来自技高网...

【技术保护点】
人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将人脐带间质干细胞在无血清培养基上培养45～50h，收集培养上清液，离心，收集上层液，得到人脐带间质干细胞外泌体粗液；(2)将所述步骤(1)中人脐带间质干细胞外泌体粗液经超滤浓缩离心，得到浓缩液；所述超滤用超滤膜为100000Da规格；所述离心速度为1000～2000g；所述离心时间为15～20min；(3)将所述步骤(2)中的浓缩液移至质量浓度为30％的蔗糖重水密度垫上，在4℃条件下，80000～160000g密度梯度离心120min，收集底部缓冲垫；(4)将所述步骤(3)中底部缓冲垫经PBS溶液洗涤后置于100000DaMWCO超滤离心管中洗涤，收集浓缩液，得到人脐带间质干细胞外泌体。

【技术特征摘要】
1.人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将人脐带间质干细胞在无血清培养基上培养45～50h，收集培养上清液，离心，收集上层液，得到人脐带间质干细胞外泌体粗液；(2)将所述步骤(1)中人脐带间质干细胞外泌体粗液经超滤浓缩离心，得到浓缩液；所述超滤用超滤膜为100000Da规格；所述离心速度为1000～2000g；所述离心时间为15～20min；(3)将所述步骤(2)中的浓缩液移至质量浓度为30％的蔗糖重水密度垫上，在4℃条件下，80000～160000g密度梯度离心120min，收集底部缓冲垫；(4)将所述步骤(3)中底部缓冲垫经PBS溶液洗涤后置于100000DaMWCO超滤离心管中洗涤，收集浓缩液，得到人脐带间质干细胞外泌体。2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养的温度为36～38℃；所述培养时环境CO2的体积浓度为4％～6％。3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文荣，孙瑶湘，钱晖，张斌，史惠，纪成，孙丰田，严永敏，张徐，毛飞，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32