一种诱导分化的细胞制备间充质干细胞的方法及调控靶点的组合技术

本发明专利技术公开了一种诱导分化的细胞制备间充质干细胞的方法及调控靶点的组合。所述方法对分化的细胞进行定向诱导制备得到间充质干细胞，所述定向诱导包括抑制TGF‑β的信号通路，抑制PKC的活性，激活WNT/β‑catenin的信号通路以及激活cAMP的信号通路。本发明专利技术通过分阶段调控相应的信号通路和/或酶的活性将分化的细胞诱导为间充质干细胞，本发明专利技术通过采用小分子化合物组合分阶段调控相应的靶点，能够将分化的细胞重编程为间充质干细胞，各步骤可实现精准质控，便于标准化操作和规模化生产。本发明专利技术提供的方法供体来源广泛，患者本人即可作为供体，可在较短时间内获得基础研究、临床治疗或组织工程生产所需的间充质干细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导分化的细胞制备间充质干细胞的方法及调控靶点的组合
本专利技术涉及细胞生物学，组织工程和再生医学领域，尤其涉及一种诱导分化的细胞制备间充质干细胞的方法及调控靶点的组合。
技术介绍
间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于人体骨髓、脂肪、外周血液中，与胚胎干细胞或iPS细胞相比，间充质干细胞具有更高的安全性、稳定性与低免疫原性，在骨与关节损伤、肿瘤、肝硬化、糖尿病、退行性疾病、神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮等疾病的临床研究或临床治疗中已有较成熟的应用，具有巨大的产业价值，但存在数量稀少、来源有限、难以富集、获取过程复杂、受供体健康状态限制、细胞易老化、无法大量传代扩增等局限，因而未能广泛应用。胚胎干细胞与iPS细胞可经过诱导获得间充质干细胞，但由于胚胎干细胞与iPS细胞本身均存在伦理问题或安全隐患，因此未能广泛应用。目前利用细胞转分化技术已经可以通过诱导分化的细胞如皮肤成纤维细胞获得其它类型的功能体细胞，如肌细胞、神经元、干细胞等。其中，采用小分子化合物及其组合诱导的直接转分化技术具备以下特点：①不导入外源性转录因子,不改变源细胞的基因结构，具有良好的安全性与稳定性，无免疫原性；②诱导系统较为稳定，易于质控，成本低廉；③诱导过程短，效率高，便于规模化生产。因此有望成为再生医学种子细胞研发及生产的基础技术。传统的细胞转分化需要通过导入特定的外源性基因实现，有时还需要相应的小分子化合物或信号分子协同作用。文献已有较多采用特定外源性基因把某一分化的细胞诱导为另一功能性分化的细胞的报道。如文献已有采用BMP-2，BMP-7，LMP3单独或协同作用使皮肤成纤维细胞转分化为在体外、体内都具有骨形成作用的成骨细胞的报道。但导入外源性基因存在致瘤风险，并可能使目标细胞产生免疫原性，因而难以推广应用。2013年，邓宏魁报道仅采用小分子化合物或其组合可以实现鼠皮肤成纤维细胞重编程为神经细胞的转分化过程，并证实该细胞转分化技术具有诱导过程短、诱导系统稳定、易于质控、成本低、无外源性基因插入导致的致瘤风险、获得的目标细胞具有良好的安全性与稳定性且无免疫原性，具有潜在的临床应用价值与产业化前景。此后，申请号为201410075246.5的中国专利申请提供了一种把分化的细胞诱导转分化为神经干细胞的方法及其应用。具体地，该申请涉及采用组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂、糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂和转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂的组合，在正常生理低氧环境下诱导成纤维细胞、上皮细胞等分化的细胞转分化为具有良好多能性及传代稳定性的神经干细胞。申请号为201610213644.8的中国专利申请提供了一种诱导成纤维细胞转分化为心肌细胞的诱导培养基、方法及其应用，所述诱导培养基包含基础培养基和诱导小分子组合，所述诱导小分子组合为6TCFOW或SCFOV，其中6为E61541、T为苯环丙胺、C为CHIR99021、F为毛喉素、O为Dorsomorphin、W为IWR-1、S为SB431542、V为丙戊酸。该申请诱导培养基能够将成纤维细胞诱导转分化为心肌细胞。目前，通过采用单纯小分子化合物或其组合诱导人类分化的细胞如皮肤成纤维细胞获得施旺细胞(THOMAEC，etal，2014)、神经细胞(HUW，etal，2015)、胰岛细胞(ShengDing，etal，2015)的成果已陆续见诸报道。由于人类与小鼠存在约25％的基因差异，而将上述在小鼠细胞实验中获得成功的专利申请技术方案应用于人类细胞同类重编程的可行性不高；另一方面，由于采用同类细胞通过转分化获得不同目标细胞的具体理论基础与技术手段并不相同，采用上述技术方案并不能获得未见报道的其它类型分化的细胞。申请人采用上述报道的技术方案分别重复试验，既未能把应用于小鼠细胞的重编程技术方案成功应用于人的同类细胞重编程，也未能把人类分化的细胞诱导重编程为间充质干细胞。多种分化的细胞如皮肤成纤维细胞具有来源丰富、易于获取并易于在体外长期大量扩增培养的优点。目前利用细胞转分化技术已经可以把分化的细胞如皮肤成纤维细胞直接诱导为成肌细胞、神经元、肝细胞、成骨细胞等多种不同类型的功能细胞；或先诱导为多能干细胞后，再进一步定向诱导为相应的功能细胞。上述采用细胞转分化技术从某种特定分化的细胞如皮肤成纤维细胞直接或间接诱导获得的功能细胞已经不再保持源细胞的分子特征与功能，但获得了相应目标细胞的典型分子特征与细胞功能。目前，上述诱导性功能细胞已逐渐应用于疾病模型研究、临床治疗研究与组织工程研究。传统的细胞转分化需要通过导入特定的外源性基因实现，有时还需要相应的小分子化合物、细胞因子或重组蛋白协同作用。文献已有较多采用特定外源性基因把某一分化的细胞诱导为另一功能性分化的细胞的报道。如文献已有采用BMP-2，BMP-7，LMP3单独或协同作用使皮肤成纤维细胞转分化为在体外、体内都具有骨形成作用的成骨细胞的报道。但导入外源性基因存在致瘤风险，并可能使目标细胞产生免疫原性，难以推广应用。2013年，邓宏魁报道仅采用小分子化合物或其组合可以实现鼠皮肤成纤维细胞重编程为神经细胞的转分化过程，并证实该细胞转分化技术具有诱导过程短、诱导系统稳定、易于质控、成本低、无外源性基因插入导致的致瘤风险、获得的目标细胞具有良好的安全性与稳定性且无免疫原性，具有潜在的临床应用价值与产业化前景。此后，申请号为201410075246.5的中国专利申请提供了一种把分化的细胞诱导转分化为神经干细胞的方法及其应用。具体地，该申请涉及采用组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂、糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂和转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂的组合，在正常生理低氧环境下诱导成纤维细胞、上皮细胞等分化的细胞转分化为具有良好多能性及传代稳定性的神经干细胞。申请号为201610213644.8的中国专利申请提供了一种诱导成纤维细胞转分化为心肌细胞的诱导培养基、方法及其应用，所述诱导培养基包含基础培养基和诱导小分子组合，所述诱导小分子组合为6TCFOW或SCFOV，其中6为E61541、T为苯环丙胺、C为CHIR99021、F为毛喉素、O为Dorsomorphin、W为IWR-1、S为SB431542、V为丙戊酸。该申请诱导培养基能够将成纤维细胞诱导转分化为心肌细胞。目前，通过采用单纯小分子化合物或其组合诱导人类分化的细胞如皮肤成纤维细胞获得施旺细胞(THOMAEC，etal，2014)、神经细胞(HUW，etal，2015)、胰岛细胞(ShengDing，etal，2015)的成果已陆续见诸报道。由于人类与小鼠存在约25％的基因差异，而将上述在小鼠细胞实验中获得成功的专利申请技术方案应用于人的同类细胞转分化可行性不高；另一方面，由于诱导同类细胞转分化获得不同目标细胞的具体理论基础与技术手段并不相同，申请人采用上述报道的技术方案分别重复试验，既未能把应用于小鼠细胞的转分化技术方案成功应用于人的同类细胞转分化，也未能把人类分化的细胞诱导转分化为间充质干细胞。
技术实现思路
本专利技术提供了一种诱导分化的细胞制备间充质干细胞的方法及调控靶点的组合。本专利技术通过利用小分子化合物组合按时序分阶段处理分化的细胞快速稳定程序化地本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导分化的细胞制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法对分化的细胞进行定向诱导，最终制备得到间充质干细胞，所述定向诱导包括抑制TGF‑β的信号通路，抑制PKC的活性，激活WNT/β‑catenin的信号通路以及激活cAMP的信号通路。

【技术特征摘要】
1.一种诱导分化的细胞制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法对分化的细胞进行定向诱导，最终制备得到间充质干细胞，所述定向诱导包括抑制TGF-β的信号通路，抑制PKC的活性，激活WNT/β-catenin的信号通路以及激活cAMP的信号通路。2.如权利要求1所述的诱导分化的细胞制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述定向诱导还包括激活RA的信号通路和/或抑制DNMT的活性和/或抑制HMT的活性和/或抑制组蛋白去甲基化酶的活性和/或抑制JNK的信号通路和/或抑制ROCK的信号通路和/或抑制赖氨酸脱乙酰基酶活性，最终制备得到间充质干细胞。3.如权利要求1或2所述的诱导分化的细胞制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述定向诱导前对分化的细胞进行预处理，所述预处理包括抑制TGF-β的信号通路，激活WNT/β-catenin的信号通路和激活cAMP的信号通路；或所述预处理包括抑制赖氨酸脱乙酰基酶(Lysinedeacetylasesinhibitors，KDACIs)的活性，抑制TGF-β的信号通路，激活WNT/β-catenin的信号通路和激活cAMP的信号通路。4.如权利要求1～3任一所述的诱导分化的细胞制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述TGF-β的信号通路特指I型TGF-β受体参与的信号通路，所述cAMP的信号通路为EPAC/RAP1的信号通路。5.如权利要求3所述的诱导分化的细胞制备间充质干细胞的方法，其特征在于，分化的细胞通过所...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡敏，李燕皎，
申请(专利权)人：云南济慈再生医学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：云南,53