本发明专利技术提供了一种短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus），保藏号为CCTCC M 2018057，保藏在中国典型培养物保藏中心。本发明专利技术所述短小芽孢杆菌对家蚕核型多角体病毒（BmNPV）具有显著的抗感染作用，细胞学感染试验显示防治病毒感染的效果达到100%。本发明专利技术在国内外首次发现了家蚕肠道微生物短小芽孢杆菌菌株（Bacillus pumilus SW41）具有显著的抗病毒感染的活性，应用于养蚕业防治蚕的病毒病具有广阔的前景。
Bacillus subtilis and its application in controlling silkworm nuclear polyhedrosis virus infection
The invention provides a short Bacillus Bacillus (pumilus), with a storage number of CCTCC M M 2018057, which is kept in the typical culture preservation center of China. The Bacillus subtilis has a significant anti infection effect on the Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV), and the cytological infection test showed that the effect of the virus infection was 100%. It has been discovered for the first time that the Bacillus pumilus SW41 of the silkworm intestinal microflora has significant antiviral activity. It has a broad prospect for the virus disease of silkworm in silkworm breeding.
【技术实现步骤摘要】
一种短小芽孢杆菌及其防治蚕核型多角体病毒感染的应用
本专利技术涉及微生物应用
，具体涉及一种短小芽孢杆菌SW41（BacilluspumilusSW41）。
技术介绍
家蚕核型多角体病毒病主要是由病毒（BmNPV）通过蚕的肠道感染而引起蚕严重发病的一类传染性蚕病，目前是危害养蚕业最严重的病毒病之一，给养蚕业者带来了巨大的经济损失，目前对该病的防治主要是通过对养蚕环境的化学药物消毒及选育使用抗病品种。短小芽孢杆菌是一类在环境中分布较为广泛的细菌，多数种类对环境与生物是友好的，迄今在降解环境有害物质及促进动植物生长方面已有一些应用报道，但可作为肠道益生菌应用于防治肠道病毒病的感染国内外尚未有报道，本专利技术提供了应用微生物从肠道内防治病毒病感染的新途径和新技术。
技术实现思路
鉴于家蚕核型多角体病毒病在养蚕业的严重危害性及防治现状，本专利技术申请人开展了寻求应用微生物防治该病毒病的研究，首次成功地分离到了具有显著抗家蚕核型多角体病毒（BmNPV）感染的微生物。本专利技术所涉及的具有显著抗家蚕核型多角体病毒（BmNPV）感染的微生物，是从蚕的消化道及消化液中分离出的一株短小芽孢杆菌SW41（BacilluspumilusSW41）。该菌株已于2018年1月24日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉），其简称CCTCC，保藏号为CCTCCM2018057。菌株接种于普通牛肉膏蛋白胨固体培养基,28℃培养24h，菌株出现半透明型和不透明型两种不同的菌落形态，菌落颜色为乳白色，显微镜观察，菌体呈杆状，圆末端，单个或呈短链排列，1.2～1.5×2.0～4.0微米，能运动，革兰氏阳性，芽孢1.0～1.2×1.5～2.0微米，椭圆形，中生或次端生。生长温度区间15～45℃，生长适温20～35℃，pH5.0～10.0。16SrDNA核心序列1542bp，根据形态学特征和16SrDNA核心序列比对SW41被鉴定为一种短小芽孢杆菌，记录为BacilluspumilusSW41，其16SrDNA核心序列在NCBI/GenBank的登录号为HM584798。（图1）。SW41发酵上清液和无菌水处理后的病毒粒子BV分别加入到家蚕细胞中进行细胞培养，并连续观察和比较感染情况，细胞学感染试验结果显示SW41发酵上清液处理区一直未有感染细胞，但空白处理区在48小时即可看到细胞感染并形成病毒多角体，96小时细胞破碎并释放出病毒多角体，细胞学试验结果显示防治病毒感染的效果达100%。（图2）。SW41发酵上清液或菌体可应用于添加到桑叶或饲料以及制作成含菌的粉状饲料饲养家蚕，其感染试验与空白对照相比防治效果可达50%~100%。有益效果1.本专利技术申请人基于多年专注于研究蚕的肠道微生态，探索了肠道微生物与肠道病毒的互作关系，终于从蚕的消化液中分离鉴定出了一株肠道菌短小芽孢杆菌（BacilluspumilusSW41）具有显著抗家蚕核型多角体病毒（BmNPV）感染的活性，该发现在国内外首次证明了动物肠道共生的个别微生物菌株具有拮抗肠道病毒感染的作用。2.本专利技术所述短小芽孢杆菌SW41对家蚕无致病性，作为肠道益生菌应用于防治肠道病毒病的感染具有显著的作用，本专利技术提供了应用微生物从肠道防治病毒病感染的新途径和新技术。附图说明图1.短小芽孢杆菌SW41（BacilluspumilusSW41）的菌落菌体及16SrDNA基因的PCR。A-SW41的菌落特征；B-菌体形态；C-16SrDNA基因PCR产物的电泳图。图2.病毒感染细胞学试验：SW41发酵上清液和无菌水处理后的病毒粒子BV分别加入到家蚕细胞中进行细胞培养，并连续观察和比较感染情况。上排图片显示的是SW41处理在24、48、72、96小时细胞未感染的生长情况，下排图片显示的是无菌水water处理在24、48、72、96小时细胞被感染的情况，96小时细胞破碎释放出病毒多角体。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只能用于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本专利技术的内容作出一些非本质的改进和调整。实施例一、短小芽孢杆菌SW41（BacilluspumilusSW41）的分离鉴定1、菌株分离：培养基：0.3%牛肉膏；1%蛋白胨；0.5%NaCl；1.8%琼脂；蒸馏水100ML；pH7.0。分别采用桑叶和柘叶饲喂家蚕，建立对家蚕核型多角体病毒易感的疾病模型和非易感的疾病模型，分别从肠道消化液中分离菌群，从抗感染的家蚕消化道中分离出可能的目标菌，30℃，恒温培养。2、纯化：牛肉膏蛋白胨培养基：0.3%牛肉膏；1%蛋白胨；0.5%NaCl；2%琼脂；1%黄姜干粉；蒸馏水；pH7.0。察氏（Czapek）改良培养基：0.2%NaNO3或NaNO2；0.1%K2HPO4；0.05%KCl；0.05%MgSO4；0.001%FeSO4；2%蔗糖；2%琼脂；1%黄姜干粉；蒸馏水；pH7.0。高氏（Gause）1号改良培养基：0.1%KNO3；0.05%K2HPO4；0.05%NaCl；0.05%MgSO4；0.001%FeSO4；2%可溶性淀粉；2%琼脂；蒸馏水；pH7.0。挑取培养物，用生理盐水稀释，在上述三种培养基上划线接种菌株，30℃，恒温培养。3、分子生物学鉴定：纯化菌株接种在100ml液体培养基（0.3%牛肉膏；1%蛋白胨；0.5%NaCl；蒸馏水；pH7.0）中，30～35℃，148～182r/min，振荡培养48～60h。参照Sambrook.J的《MolecularCloning:ALaboratoryManual》（3thEd,2000，ColdSpringHarborLaboratoryPress），提取菌体基因组，PCR引物是5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3',用PCR方法进行扩增，获得该菌的16SrDNA核心序列为1542bp，应用BLAST搜索工具进行该菌株16SrDNA核心序列（GenBank/HM584798）和GenBank数据库中其他菌株16SrDNA核心序列比对，依据邻接法构建的进化树显示SW41菌株与短小芽孢杆菌具有高度的相似性，被鉴定为短小芽孢杆菌，该菌株的16SrDNA核心序列在美国NCBI数据库获得的基因登录号为（GenBank/HM584798）。实施例二、抗病毒感染细胞学鉴定1、液体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCL5g，蒸馏水1000mL；2、菌种发酵：挑取SW41菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，25~28℃，200r/min发酵培养72小时，将发酵液10000rpm/min离心10min，取上清过滤除菌，将过滤后的上清存放在无菌的离心管中；3、细胞感染试验：使用发酵上清液处理病毒粒子BV及ODV，28℃孵育1小时，然后5~10℃条件下15000g/min离心30min，弃上清，加入1mLTC100细胞培养基，然后15000g/min离心30min，弃上清，加入1mLTC100细胞培养基，刮沉淀，涡旋10min，并用无菌水处理做对照。分别用SW41发酵上清和无菌水处理过的BV/ODV加入本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种短小芽孢杆菌（
【技术特征摘要】
1.一种短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus），保藏号为CCTCCM2018057，保藏在中国典型培养物保藏中心。2.如权利要求1所述的短小芽孢杆菌，16SrDNA核心序列1542bp，在NCBI/GenBank的登录号HM584798。3.如权利要求1或2所述的短小芽孢杆菌，分离自家蚕消化道或消化液。4.如权利要求1-3任一所述的短小芽孢杆菌，菌落乳白色，半透明或不透明，菌体杆状，圆末端，大小1.2～...
【专利技术属性】
技术研发人员：万永继，周围，刘仁华，王文慧，向庭婷，刘晓媛，卢延，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50
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