一种金黄色葡萄球菌及含该菌的海洋哺乳动物疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种金黄色葡萄球菌及含该菌的海洋哺乳动物疫苗，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus DCS5菌株保藏号为CGMCC No.15124。本发明专利技术还公开了一种海洋哺乳动物疫苗，所述疫苗包括抗原液，所述抗原液为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus DCS5菌株的灭活浓缩菌液，菌液浓度≥4×10

Staphylococcus aureus and marine mammal vaccine containing this bacterium

The invention discloses a vaccine of Staphylococcus aureus and the marine mammal containing the bacteria, and the preservation number of Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus DCS5 is CGMCC No.15124. The invention also discloses a marine mammal vaccine. The vaccine includes an antigen liquid, the antigen liquid is an inactivated concentrate liquid of Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus DCS5 strain, the concentration of the bacterial liquid is more than 4 * 10.

【技术实现步骤摘要】
一种金黄色葡萄球菌及含该菌的海洋哺乳动物疫苗
本专利技术属于疫苗
，具体地，本专利技术涉及一种金黄色葡萄球菌以及将其灭活后制备得到的海洋哺乳动物疫苗。
技术介绍
随着人民生活水平的提高，物质需求向精神需求的转变，促进了国内水族馆行业飞速发展，对海洋哺乳动物资源的需求随之越来越多，尤其是具有展演展示天赋的鲸类动物，如瓶鼻海豚、白鲸等，在国内各水族馆饲养的数量不断攀升。据不完全统计全国海洋哺乳动物拥有总量达2560头，每年可创造巨大的经济产值。然而，虽然国内水生哺乳动物医疗保健水平在不断的提升，但是每年仍有大量的鲸类动物出现死亡。在死亡的众多原因中，肺炎占死亡比例的80％以上。其中美国海军对海洋哺乳动物海豚进行研究表明50％(21/42)患有肺炎。其中细菌感染性肺炎占到总感染的42.9％，而金黄色葡萄球菌的感染又占到细菌性疾病的19％，表明金黄色葡萄球菌是细菌性肺炎的重要原因。目前，海洋哺乳动物金黄色葡萄球菌感染常用的治疗方法为抗生素治疗，而金黄色葡萄球菌的耐药问题在临床中愈来愈突出。因此，研制出一种能够提升海洋哺乳动物免疫力的高效金黄色葡萄球菌疫苗显得势在必行。通过金黄色葡萄球菌疫苗的免疫接种，可使馆养鲸类动物获得外源性免疫刺激，进而提升对疾病的抵抗能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种金黄色葡萄球菌以及将其灭活得到的海洋哺乳动物疫苗。本专利技术提供的疫苗具有高效、安全和稳定等优点，本专利技术为安全、高效、全面有效预防金黄色葡萄球菌感染性海洋哺乳动物疾病提供了有力保证。为达到上述目的，本专利技术采用了如下的技术方案：一种金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusDCS5菌株，菌种保藏号为CGMCCNo.15124。本专利技术中，所述DCS5菌株为从海洋哺乳动物中分离得到，所述海洋哺乳动物为海豚、海鲸、海狮或海象。本专利技术还提供了一种海洋哺乳动物疫苗，所述疫苗包括抗原液，所述抗原液为权利要求1所述金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusDCS5菌株的灭活浓缩菌液，菌液浓度≥4×109个细菌/mL。进一步地，所述疫苗还包括疫苗佐剂，抗原液：疫苗佐剂的质量比为70：30～60：40。本专利技术中，所述疫苗的剂型为皮下注射剂或肌肉注射剂。本领域技术人员还可以根据需要制备其他剂型。优选地，所述灭活浓缩菌液的制备方法包括如下步骤：1)从海洋哺乳动物的气孔喷出物中分离出金黄色葡萄球菌，通过培养、纯化、分子生物学和生化鉴定符合金黄色葡萄球菌的特征，命名为金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusDCS5菌株；2)对分离纯化得到的金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusDCS5菌株进行扩大培养、灭活、浓缩得到灭活浓缩菌液。本专利技术进一步提供了一种海洋哺乳动物疫苗的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将抗原液和疫苗佐剂按照比例进行搅拌乳化，即得到海洋哺乳动物疫苗。优选地，所述将抗原液和疫苗佐剂按照比例进行搅拌乳化具体为：将疫苗佐剂倒入容器中，以1000rpm/min的转速进行搅拌10s～60s，再将抗原液缓慢加入疫苗佐剂中后将转速增加到5000～10000rpm/min，保持3～20min。本专利技术还提供了一种金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusDCS5菌株在制备海洋哺乳动物疫苗中的应用。本专利技术保护菌株DCS5菌株在制备海洋哺乳动物动物疫苗中的应用。所述DCS5菌株可为海洋哺乳动物海豚中分离的金黄色葡萄球菌菌株。本专利技术还保护一种海洋哺乳动物疫苗，其活性成分为灭活后的菌株DCS5株，按照一定比例加入佐剂乳化后得到。具体来说，所述灭活后的菌株DCS5株的浓度可为4×109CFU/mL。本专利技术“灭活后的菌株”可通过将所述菌株进行甲醛灭活得到。所述“灭活后的菌株”具体通过如下方法得到：取菌液加入37％-40％甲醛溶液并使甲醛浓度为0.4％(体积比)，37℃、150rpm/min振荡孵育36-48h，离心(离心参数具体可为：4℃、6500rpm/min离心15min收集菌体)收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体，得到“灭活后的菌株”(至少含细菌4×109CFU/mL)。本专利技术所述佐剂为Seppic公司MontanideTMISA763AVG佐剂或铝胶佐剂。本领域技术人员还可以根据需要使用其他佐剂。本专利技术提供的菌株DCS5株全称为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)DCS5菌株。该DCS5菌株已于2017年12月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo.15124。附图说明图1为实施例1中细菌活菌数与时间对应关系的生长曲线；图2为实施例1中细菌OD540值与时间对应关系的生长曲线；图3为实施例1中金黄色葡萄球菌对小鼠的致病性试验攻毒后小鼠的存活率的生长曲线。具体实施方式下面以附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。MontanideTMISA763AVG佐剂：是一种油基佐剂，研制用于生产油包水乳剂。它含可注射降解的油(不含矿物油)以及从甘露醇中精炼和纯化植物来源油酸的乳化剂和一种从来源于植物的甘露醇和纯油酸中提取并特别精炼的乳化剂，购于Seppic公司。Balb/C小鼠(5周龄)：购自军事医学科学院实验动物中心。新西兰兔(1.5Kg)：购于北京芳元缘养殖场。实施例1、菌株的获得和保藏一、采集12只海洋哺乳动物的气孔喷出物于无菌塑料小瓶中，观察发现部分动物气孔喷出物中存在白色或灰色黏液。从海洋哺乳动物气孔喷出物中分离纯化金黄色葡萄球菌菌株。金黄色葡萄球菌的菌落形态特征(37℃，培养24-72h)：(1)脑心浸液琼脂培养基：形成光滑湿润隆起的边缘整齐不透明有黄色色素的圆形菌落，直径约1-2mm。(2)血琼脂平板(新鲜脱纤维绵羊血)：在血平板上形成较大的光滑凸起湿润菌落，菌落周围形成完全透明β溶血环。(3)Baird-parker培养基：菌落直径为2mm-3mm，颜色呈黑色，边缘为淡色，周围有一周浑浊带，外围有一层透明圈，用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度。金黄色葡萄球菌的鉴定结果表明，(1)待检菌株能与兔血浆37℃培养后发生血浆凝固的现象，血浆凝固酶阳性。(2)待检菌液接种于甘露醇发酵管中结果甘露醇由紫色变为黄色，表明待检菌株可分解利用甘露醇。(3)将待检菌株的BHI培养物用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA平板，在刺种线周围出现淡粉色，表明耐热核酸酶试验阳性。(4)高盐生长试验结果为阳性，(5)氧化酶试验结果为阳性，(6)明胶液化试验结果为阴性(7)硝酸盐产气试验结果为阴性(8)取菌落，进行革兰氏染色，可见革兰氏阳性呈葡萄串状排列的球菌。将菌株命名为金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusDCS5株。二、菌株的扩大培养1、将金黄色葡萄球菌DCS5株(原代菌株)按照一定比例接种至BHI液体培养基，于37℃，150rpm/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus DCS5菌株，菌种保藏号为CGMCC No.15124。

【技术特征摘要】
1.一种金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusDCS5菌株，菌种保藏号为CGMCCNo.15124。2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusDCS5菌株，其特征在于，所述DCS5菌株为从海洋哺乳动物中分离得到。3.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusDCS5菌株，其特征在于，所述海洋哺乳动物为海豚、海鲸、海狮或海象。4.一种海洋哺乳动物疫苗，其特征在于，所述疫苗包括抗原液，所述抗原液为权利要求1所述金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusDCS5菌株的灭活浓缩菌液，菌液浓度≥4×109个细菌/mL。5.根据权利要求4所述的海洋哺乳动物疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括疫苗佐剂，抗原液：疫苗佐剂的质量比为70：30～60：40。6.根据权利要求4所述的海洋哺乳动物疫苗，其特征在于，所述疫苗的剂型为皮下注射剂或肌肉注射剂。7.根据权利要求4所述的海洋哺乳动物疫苗，其特征在于，所述灭...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凌云，郑杰，马宁宁，孙艳明，张萌，候野，李燕，李磊，相伟，
申请(专利权)人：北京鼎持生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11