解淀粉芽孢杆菌及培养芽孢和菌剂的制备方法与应用技术

一种深海解淀粉芽孢杆菌及高密度培养的芽孢制剂制备及其应用，属于微生物技术领域。一株深海分离的解淀粉芽孢杆菌菌株，其分类学命名为：解淀粉芽孢杆菌B10，已保藏于中国典型培养物保藏中心。该解淀粉芽孢杆菌菌株B10可以利用广泛的碳、氮源通过液体发酵产生芽孢，并在代谢过程中产生少量fengycins类杀真菌并诱导植物系统抗性的化合物，在产脂肽培养基发酵条件下能够产生较高产量的fengycins(20‑35mg/L)。由该解淀粉芽孢杆菌菌株制备的生物防治制剂，可以作为生物农药或生物肥料，单独或与其他药剂复配或化肥包膜，通过喷施、灌根或施肥、追肥来防治植物真菌性病害，达到提高植物产量和提高品质的目的。

Preparation and application of Bacillus amylulis and culture spore and inoculants

The invention relates to a preparation and application of a deep-sea Bacillus amylus and a high density culture spore preparation, belonging to the microbial technology field. A deep-sea isolate of Bacillus amylus, its taxonomy is named Bacillus amylum B10, which has been preserved in the typical culture preservation center of China. The Bacillus amyloid strain B10 can produce spores by a wide range of carbon and nitrogen sources through liquid fermentation, and produces a small amount of fengycins like fungicidal and plant system resistance compounds in the metabolic process. It can produce a higher yield of fengycins (20 35mg/L) under the fermentation condition of the lipoid medium. The biological control preparation prepared by this bacillus amylum strain can be used as biological pesticide or biological fertilizer, alone or in combination with other chemicals or chemical fertilizer coating, to control plant fungal diseases by spraying, root irrigation, fertilization and fertilizer recovery to improve plant yield and high quality.

【技术实现步骤摘要】
解淀粉芽孢杆菌及培养芽孢和菌剂的制备方法与应用
本专利技术涉及一种深海分离解淀粉芽孢杆菌的高密度培养及芽孢制剂制备与应用，属于微生物

技术介绍
芽孢杆菌(Bacilussp.)在自然界中广泛存在，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。通过成功定殖至植物根际、体表或体内，芽孢杆菌与病原菌竞争植物周围的营养，分泌抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，抑制植物病原菌，包括根部、叶部、枝干、花部和收获后果实等多种病害，是一种较理想的生防微生物(Ongena,etal.,2008)。至今发现Bacilus属的拮抗细菌能产生100多种抗菌物质，大部分为肽类抗生素，分子量为300-3000Da，它们可能含有L/D-氨基酸和非蛋白氨基酸，一般能抵抗蛋白酶的降解。其中分子量1000Da左右的环肽或环脂肽，诸如iturins,surfactins,fengycins为芽孢杆菌主要产生种类。这些环脂肽类物质都由一个氨基酸环和一条脂肪链组成。对植物病原真菌有较强抗菌活性(Lanzotti,etal.,2011)。很多研究表明，芽孢杆菌作为活体微生物制剂对植物病原菌进行生物防治时，其抗菌作用源于其产生的脂肽类抗生素。此外，芽孢杆菌的脂肽类物质不仅能直接发挥抗菌作用，还能激发宿主植物对植物病原真菌的防御机制，诱导植物体产生系统抗性(InducedSystemicResistance,ISR)作用。而ISR也是生防细菌重要的防病机制之一。研究发现豆类、西红柿等能够感应surfactins和fengycins类化合物，并且将后者作为信号激活其防御机制，即植物体产生了ISR(Ongena,etal.，2007)。更有研究工作表明，脂肽还影响其产生菌的生态适应性-促进根部芽孢杆菌菌落的建立(使其在根部周围永久存在)。微生物产生三大类脂肽的作用表明，脂肽对于生防菌发挥防病促生作用非常重要，且往往是多种化合物协同发挥作用，包括抗菌、诱导植物抗性和帮助细菌在植物根际的定殖等。因此，生防菌如能同时作为植物根际促生菌((PlantGrowth-PromotingRhizobacterium,PGPR)，相较于用化学农药难以奏效土传病害的防治具有特别的优势。对土传病害的防治来说，能在根际生长的微生物才是理想的生防因子。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株深海分离的解淀粉芽孢杆菌及其高密度培养的制剂制备方法与应用。由该菌株在该方法培养下能够产生高密度芽孢，在代谢过程中产生少量fengycins类杀真菌并诱导植物系统抗性的化合物，在产脂肽培养基发酵条件下能够产生较高产量的fengycins。由该解淀粉芽孢杆菌菌株制备的生物防治制剂，可以作为生物农药或生物肥料，具有成本低、生防高效、无残留、对人畜安全的特点。单独或与其他药剂复配或化肥包膜，通过喷施、灌根或施肥、追肥来防治植物真菌性病害，达到提高植物产量和提高品质的目的。本专利技术的技术方案：一株深海分离的解淀粉芽孢杆菌菌株，其分类学命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacilusamyloliquefaciens)B10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCCNO：M2017486。该菌株B10可以利用广泛的碳、氮源通过液体发酵产生芽孢，并在代谢过程中产生少量fengycins类杀真菌并诱导植物系统抗性的化合物，在产脂肽培养基发酵条件下能够产生较高产量的fengycins(20-35mg/L)。所述的解淀粉芽孢杆菌的高密度培养芽孢制剂制备方法，是通过以下步骤来完成：(1)斜面菌体活化及种子准备无菌操作接种B10菌株保藏菌种，划线于牛肉膏蛋白胨培养基琼脂平皿，培养基组成以g/L计为：牛肉膏3，蛋白胨5，陈海水或人工海水1000，琼脂15-20，pH7.0-7.2；25-50℃培养24-48h；然后挑取单菌落划线接种牛肉膏蛋白胨斜面，25-50℃培养24-48h，镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，准备移种；准备如500mL三角摇瓶，装量100mL，培养基组成组以g/L计为：玉米面10-25，豆饼粉0.1–5，麸皮1-10，K2HPO40.1-1.0，碳酸钙0.1-10.0，pH6.0-7.0；以体积比1-10％的接种量接入，摇床120-200rpm在25-50℃培养24-48h，镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，将摇瓶在80℃水浴中加热10min，准备移种；(2)种子罐培养于种子摇瓶选用3000mL三角瓶，装液量1000mL，以体积比1-10％接入上述种子，摇床120-200rpm在25-50℃培养24-48h，以此做种，以体积比1-10％接入种子罐培养，种子罐选10L、20L、30L、50L或100L,种子罐的装量体积比为60-70％；培养基组成以g/L计为：玉米面10-25，豆饼粉0.1-5麸皮1-10，K2HPO40.1-1.0，碳酸钙0.1-10.0，pH6.0-7.0，豆油3-5或泡敌0.1-0.5；种子罐培养条件为：搅拌转速150-300rpm，通气量0.5-1m3/h,DO保持30％以上，培养温度25-50℃，培养时间15-52h；(3)发酵罐培养种子培养液以体积比1-10％接入发酵罐中，选用1T、2T、5T或10T体积发酵罐，发酵罐的装量体积比为60-70％；发酵罐培养基组成：发酵培养基由碳源、氮源和无机盐组成，以g/L计为：碳源10-25，氮源1-5,麸皮2-5，K2HPO40.1-1.0，碳酸钙0.1-10.0，pH6.0-7.0，豆油3-5或泡敌0.1-0.5；发酵罐培养条件为：搅拌转速≥150rpm，通气量1-2m3/h,DO保持30％以上，培养温度25-50℃，培养时间15-52h；15h开始取发酵液镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，可即放罐结束培养；取样测定芽孢数量，测得发酵液芽孢数量达1×109CFU/mL以上。(4)芽孢收集及菌剂制备将培养液泵入连续式离心机进行固液分离，获得芽孢，将芽孢与乳糖以质量比1:(1-3)的比例混合，在40-60℃干燥20-24h，粉碎机粉碎，过100目筛，按1:(1-10)的比例加入载体硅藻土、乳糖、淀粉、高岭土、轻质碳酸钙、膨润土、草炭土中的一种或多种；加入助剂包括润湿剂和分散剂，依照上述物料质量分别以1-3％的比例加入，其中润湿剂选自十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠中一种，分散剂选自羧甲基纤维素、多聚硫磷酸钠、黄原胶、MorwetD-500中的一种或多种，混合后制成的制剂，芽孢含量达到1×109CFU/mL以上。所述的制备方法，其解淀粉芽孢杆菌液体发酵的碳源和氮源选择十分广泛，碳源选用玉米粉、麸皮、葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉中的一种或几种，氮源选用豆饼粉、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、玉米浆粉、花生饼粉中的一种或几种。(5)产脂肽培养基发酵培养产生fengycins将解淀粉芽孢杆菌芽孢接入下述产脂肽培养基中，培养基以g/L计为：蔗糖20，NH4NO32，KH2PO43，Na2HPO41，MgSO4·7H2O0.2，酵母膏0.2，CaCl27μg,MnSO4·4H2O10μg，pH7.0-7.2；培养温度28℃，时间48h。fengycins检测：用0.5mol/LNaOH溶液将细菌培养液调节本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株解淀粉芽孢杆菌菌株，其分类学命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacilus amyloliquefaciens)B10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO：M 2017486，保藏日期2017年9月11日。

【技术特征摘要】
1.一株解淀粉芽孢杆菌菌株，其分类学命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacilusamyloliquefaciens)B10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCCNO：M2017486，保藏日期2017年9月11日。2.如权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌菌株，该菌株B10可以利用广泛的碳、氮源通过液体发酵产生芽孢，并在代谢过程中产生少量fengycins类杀真菌并诱导植物系统抗性的化合物，在产脂肽培养基发酵条件下能够产生较高产量的fengycins(20-35mg/L)。3.一种权利要求1或2所述的解淀粉芽孢杆菌培养芽孢的方法，其特征是，通过以下步骤来完成：1)菌体斜面活化及种子准备无菌操作接种B10菌株保藏菌种，划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基琼脂平皿，培养基组成以g/L计为：牛肉膏3，蛋白胨5，陈海水或人工海水1000，琼脂15-20，pH7.0-7.2；25-50℃培养24-48h；然后挑取单菌落划线接种牛肉膏蛋白胨斜面，25-50℃培养24-48h，镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，准备移种；准备(如：500mL)三角摇瓶，装培养基(如：装量100mL)，培养基组成以g/L计为：玉米面10-25，豆饼粉0.1-5，麸皮1-10，K2HPO40.1-1.0，碳酸钙0.1-10.0，pH6.0-7.0；以体积比1-10％的接种量接入，在摇床120-200rpm中于25-50℃培养24-48h，显微镜检查，当90％以上菌体形成芽孢时，将摇瓶在80℃水浴中加热10min，准备移种；2)种子罐培养于种子摇瓶(如：选用3000mL三角瓶，装液量1000mL)中装入培养基，以体积比1-10％接入上述种子，摇床120-200rpm在25-50℃培养24-48h，以此做种子液，并以体积比1-10％接入种子罐培养(如：种子罐选10L、20L、30L、50L或100L),种子罐的装量体积比为60-70％；培养基组成以g/L计为：玉米面10-25，豆饼粉0.1-5，麸皮1-10，K2HPO40.1-1.0，碳酸钙0.1-10.0，pH6.0-7.0，豆油3-5或泡敌0.1-0.5；种子罐培养条件为：搅拌转速150-300rpm，通气量1-2m3/h,溶解氧DO保持在该温度下的DO饱和值的30％以上，培养温度25-50℃，培养时间15-52h；3)发酵罐培养种子培养液以体积比1-10％接入发酵罐中(如：选用1T、2T、5T或10T体积发酵罐)，发酵罐的装量体积比为60-70％；发...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡江春，马宗旺，潘华奇，王楠，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21