一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法技术

本发明专利技术公开了一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法，采用改善后含蔗糖的培养基获得高密度发酵的富硒罗伊氏乳杆菌的菌体，增加了单位体积发酵液消化吸收无机硒的能力，同时通过二阶段补硒控制发酵液中硒浓度处于较低水平，便于乳酸菌利用发酵过程，将发酵液中的无机硒，完全转化为乳酸菌体内的有机硒，此外由于控制了发酵过程的硒浓度，菌体生长不受抑制，可在24h内达到较高的活菌浓度，解决了传统工艺上培养基中无机硒含量远高于乳酸菌的耐受能力而造成乳酸菌生长缓慢的问题，同时避免了所得菌体包含单质硒的问题。因此本发明专利技术获得的富硒罗伊氏乳杆菌发酵液兼具完全有机硒和高活菌数的优点。此外，本发明专利技术最终获得的微生态制剂只含有有机硒。

A high density fermentation method for selenium enriched Lactobacillus rosalis

The invention discloses a high density fermentation method of selenium rich lactobacillus, which is used to improve the high density fermentation of selenium enriched Lactobacillus mycelium in high density fermentation, increase the ability to digest and absorb inorganic selenium in the unit volume fermentation liquid, and control the selenium concentration in the fermentation liquid by two stages to control the selenium concentration at the same time. The low level is convenient for lactic acid bacteria to use the fermentation process and convert the inorganic selenium in the fermentation liquid to the organic selenium in the lactic acid bacteria. In addition, due to the control of the selenium concentration in the fermentation process, the growth of the bacteria is not inhibited. The high living bacteria concentration can be reached in the 24h, and the inorganic selenium content in the traditional culture medium is very high. The tolerance of lactic acid bacteria caused the slow growth of lactic acid bacteria, while avoiding the problem that the bacteria contained selenium. Therefore, the selenium enriched Lactobacillus fermentus produced by the invention has the advantages of full organic selenium and high viable bacteria count. In addition, the microecological preparation obtained by the invention contains only organic selenium.

【技术实现步骤摘要】
一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法
本专利技术属于一种生物制品领域，特别是涉及一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法。
技术介绍
硒是人体所必须的一种元素，可以确定的是低硒会导致大骨节病和克山病，此外缺硒会在诸多方面潜在地影响人体健康。长久以来，地区性硒源匮乏严重影响着人们的健康和生活水平，开发富硒功能性食品可以有效缓解这一问题。硒主要以无机硒盐、简单的有机硒化合物和含硒氨基酸等形式存在。有机硒的毒性较低，其中已知的含硒氨基酸有两种：硒化甲硫氨酸和硒化半胱氨酸。硒化的氨基酸可通过特殊的装配途径合成到特异性蛋白中形成了硒化蛋白。根据世界卫生组织推荐，成人每日硒摄入量应该控制在30-40μg，男子的每日最适硒摄入量为60μg，女子为53μg。富硒产品主要有两种，一种是通过向土壤喷洒硒，提高农产品的硒含量，通过该法已开发出大量的富硒农产品，如富硒的粮食、茶、蔬菜、水果等；另一种是向食品中加入富硒添加剂，这类补硒产品包括富硒的食盐、酸奶、奶粉、微生态制剂等。许多乳酸菌具有富集有机硒的功能。朱琴等人在专利“一种富硒乳酸菌制剂及其生产方法”(CN201110319785.5)报道保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和乳链球菌用于富硒，每克制剂可富集5-15mg硒。陈龙等在专利“一种富硒乳酸菌制剂及其生产方法和应用”(CN200510039258.3)报道保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和乳链球菌用于富硒，每克制剂可富集5-15mg硒。专利“一种富硒乳酸菌制剂生产方法及其复习乳酸菌制剂”(CN201310736926.2)报道保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、动物双歧杆菌、唾液乳杆菌和乳链球菌用于富硒，每克制剂可富集4-12mg硒。这三篇专利报道的硒含量远高于理论富硒量，表明其方法中带入数倍的无机硒，其所制备的乳酸菌制剂是无机硒和有机硒的混合物，并无法体现有机硒低毒的特点。秦顺义等人在专利“一种提高肉鸡肌肉肉色的富硒乳酸菌制剂及其应用”(CN201410819192.9)中报道鼠李糖杆菌用于富硒，每克制剂乳酸菌数109CFU，每克制剂硒含量5.2-22.8μg，且将近一半仍为无机硒，虽然无机硒含量大大降低，但仍是无机硒和有机硒的混合物。目前国内外制备富硒乳酸菌的培养基基本采用传统的MRS培养基。乳酸菌菌体在发酵过程中，可将发酵液中的无机硒转化为乳酸菌体内的有机硒。传统方法中，发酵后的乳酸菌浓度一般低于(0.8-5)×109CFU/ml，且在培养过程中加入的亚硒酸钠浓度在5-120mg/L,该浓度值远高于乳酸菌的耐受浓度，造成乳酸菌生长缓慢，发酵时间通常需要36h以上，耗时长且终点活菌数低，因此富硒成本较高。此外，传统方法所得发酵液中残留的亚硒酸钠极高，通常需要经过洗涤以除去大部分亚硒酸钠，洗涤后菌体中仍残留较高的在发酵过程中未被吸收转化的硒单体和亚硒酸钠，因此所得菌体多为无机硒和有机硒的混合物，影响了菌体产品的使用。针对已报道专利乳酸菌发酵密度低、获得的菌体制剂的硒产物是无机硒和有机硒混合物的问题，本案专利技术人力求研发一种提高发酵密度，降低生产成本，且最终获得的微生物制剂所含有的硒产物均为有机硒的富硒方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种发酵密度高，生产成本较低，且最终获得的微生物制剂所含有的硒产物均为有机硒的富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法。为了达成上述目的，本专利技术的技术方案是：一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法，包括如下步骤：一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法，包括如下步骤：(1)将罗伊氏乳杆菌从平板接种到种子培养基中，37℃厌氧培养12-18h，每升种子培养基配方包括以下原料：20g蔗糖、20g酵母浸膏、3.0g磷酸氢二钾，7.0g乙酸钠、1.0g柠檬酸铵、0.2g硫酸镁、0.18g硫酸锰、1.0g吐温80和余量的蒸馏水，配置时用磷酸调pH至6.2后得到种子培养基；(2)将种子按3％-10％接种量接种到发酵培养基中，厌氧培养16-24h，每升发酵培养基配方包括：80-150g蔗糖、80-150g酵母浸膏、2-7g柠檬酸铵、5-9g乙酸钠、2-6g磷酸氢二钾、0.2-0.6g硫酸锰、0.5-0.8g硫酸镁和1-3g吐温80，配置时用磷酸调pH至5.5-6.2后得到发酵培养基；(3)在步骤(2)发酵进行到4h，每升发酵培养基中加入浓度为1g/L亚硒酸钠溶液1.1-3.3ml；发酵进行到12-16h,每升发酵培养基补加浓度为1g/L亚硒酸钠溶液1.1-3.3ml，发酵进行到20-24h后发酵完成，得到终点发酵液。进一步地，还包括步骤(4)：在步骤(3)中的终点发酵液中添加稳定剂，制得富硒罗伊氏乳杆菌营养液；所述稳定剂为果胶、明胶、变性淀粉、速溶琼脂、乳蛋白、羧甲基纤维素纳、耐酸CMC、藻酸丙二醇酯、黄原胶、卡拉胶、瓜尔豆胶、阿拉伯胶中多种的组合或者其中一种。进一步地，所述乳蛋白包括酪蛋白酸钠和/或乳清蛋白。进一步地，在步骤(4)中，富硒罗伊氏乳杆菌营养液活菌数为(0.8-5)×1010CFU/ml，硒含量为1400-3000μg/L。进一步地，还包括步骤(4)：将步骤(3)中的终点发酵液进行过滤，过滤后得到富硒罗伊氏乳杆菌的菌体，然后添加冻干保护剂，将添加了冻干保护剂的菌体进行冷冻干燥，冷冻干燥后得到富硒罗伊氏乳杆菌活菌制剂；所述冻干保护剂为甘油、山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖、聚乙烯比咯烷酮、葡聚糖、奶粉、维生素E中的多种的组合或其中一种。进一步地，在步骤(4)中，通过平板菌落计数法测得，富硒罗伊氏乳杆菌活菌制剂的活菌数为(0.1-5)×1012CFU/g，硒含量为126-260μg/g。进一步地，在步骤(3)中，通过平板菌落计数法测得，罗伊氏乳杆菌在发酵培养基中培养18h时，活菌数为(0.8-5)×1010CFU/ml；发酵完成后，终点发酵液的硒含量为1200-3000μg/L，菌体硒含量为126-260μg/g。进一步地，在步骤(3)中，将终点发酵液进行离心、冷冻干燥后得到富硒罗伊氏乳杆菌的菌体，菌体干重为9-12g/L。本专利技术一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法，采用改善后含蔗糖的培养基获得高密度发酵的富硒罗伊氏乳杆菌的菌体，增加了单位体积发酵液消化吸收无机硒的能力，同时通过二阶段补硒控制发酵液中硒浓度处于较低水平，便于乳酸菌利用发酵过程，将发酵液中的无机硒，完全转化为乳酸菌体内的有机硒，此外由于控制了发酵过程的硒浓度，菌体生长不受抑制，可在24h内达到较高的活菌浓度，解决了传统工艺上培养基中无机硒含量远高于乳酸菌的耐受能力而造成乳酸菌生长缓慢的问题，同时避免了所得菌体包含单质硒的问题。因此本专利技术获得的富硒罗伊氏乳杆菌发酵液兼具完全有机硒和高活菌数的优点。综上，本专利技术具有如下优点：1、本专利技术采用高密度发酵培养基和工艺，可使得最终菌体浓度比普通MRS培养基获得的菌体浓度大大提高。2、本专利技术采用分阶段补硒策略，可以克服发酵过程中无机硒抑制菌体生长，且同时保证无机硒100％转化为有机硒，避免所获得的制剂同时包含无机硒和有机硒。3、本专利技术的工艺无需在最终发酵完成后洗涤菌体以去除未转化的无机硒，可直接作为动物引用水的添加剂等，无需其它分离操作。具体实施方式为了进一步解释本专利技术的技本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将罗伊氏乳杆菌从平板接种到种子培养基中，37℃厌氧培养12‑18h，每升种子培养基配方包括以下原料：20g蔗糖、20g酵母浸膏、3.0g磷酸氢二钾，7.0g乙酸钠、1.0g柠檬酸铵、0.2g硫酸镁、0.18g硫酸锰、1.0g吐温80和余量的蒸馏水，配置时用磷酸调pH至6.2后得到种子培养基；(2)将种子按3％‑10％接种量接种到发酵培养基中，厌氧培养16‑24h，每升发酵培养基配方包括：80‑150g蔗糖、80‑150g酵母浸膏、2‑7g柠檬酸铵、5‑9g乙酸钠、2‑6g磷酸氢二钾、0.2‑0.6g硫酸锰、0.5‑0.8g硫酸镁和1‑3g吐温80，配置时用磷酸调pH至5.5‑6.2后得到发酵培养基；(3)在步骤(2)发酵进行到4h，每升发酵培养基中加入浓度为1g/L亚硒酸钠溶液1.1‑3.3ml；发酵进行到12‑16h,每升发酵培养基补加浓度为1g/L亚硒酸钠溶液1.1‑3.3ml，发酵进行到20‑24h后发酵完成，得到终点发酵液。

【技术特征摘要】
1.一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将罗伊氏乳杆菌从平板接种到种子培养基中，37℃厌氧培养12-18h，每升种子培养基配方包括以下原料：20g蔗糖、20g酵母浸膏、3.0g磷酸氢二钾，7.0g乙酸钠、1.0g柠檬酸铵、0.2g硫酸镁、0.18g硫酸锰、1.0g吐温80和余量的蒸馏水，配置时用磷酸调pH至6.2后得到种子培养基；(2)将种子按3％-10％接种量接种到发酵培养基中，厌氧培养16-24h，每升发酵培养基配方包括：80-150g蔗糖、80-150g酵母浸膏、2-7g柠檬酸铵、5-9g乙酸钠、2-6g磷酸氢二钾、0.2-0.6g硫酸锰、0.5-0.8g硫酸镁和1-3g吐温80，配置时用磷酸调pH至5.5-6.2后得到发酵培养基；(3)在步骤(2)发酵进行到4h，每升发酵培养基中加入浓度为1g/L亚硒酸钠溶液1.1-3.3ml；发酵进行到12-16h,每升发酵培养基补加浓度为1g/L亚硒酸钠溶液1.1-3.3ml，发酵进行到20-24h后发酵完成，得到终点发酵液。2.如权利要求1所述的一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法，其特征在于，还包括步骤(4)：在步骤(3)中的终点发酵液中添加稳定剂，制得富硒罗伊氏乳杆菌营养液；所述稳定剂为果胶、明胶、变性淀粉、速溶琼脂、乳蛋白、羧甲基纤维素纳、耐酸CMC、藻酸丙二醇酯、黄原胶、卡拉胶、瓜尔豆胶、阿拉伯胶中多种的组合或者其中一种。3.如权利要求2所述的一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国，王超，李夏兰，郭洪伟，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：福建,35