科氏葡萄球菌S154及其在生物合成纳米硒中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种科氏葡萄球菌S154及其在生物合成纳米硒中的应用。本发明专利技术从土壤中分离得到一株可耐受极高浓度亚硒酸盐、硒酸盐的科氏葡萄球菌S154(保藏编号：CGMCC No.13328)，利用菌株S154合成生物纳米硒，对生物纳米硒进行分离纯化，大量制备生物纳米硒。采用生物发酵工艺制备纳米硒，具有环境友好，产率高，安全高效等特点，生产获得的生物纳米硒可用于肥料、饲料、富硒功能食品、保健品及医药产品等。

Staphylococcus Coriolis S154 and its application in biosynthesis of nano selenium

The invention provides a Staphylococcus Coriolis S154 and its application in biosynthesis of nano selenium. This invention has isolated a strain of Staphylococcus Coriolis S154 (CGMCC No.13328), which can tolerate high concentration of selenite and selenate, and uses strain S154 to synthesize biological nanosenet, and separate and purify biological nano selenium, and make a large amount of biological selenium nanoparticles. Nanometer selenium is prepared by biological fermentation technology. It has the characteristics of friendly environment, high yield and high safety and efficiency. The production of biological nano selenium can be used in fertilizer, feed, selenium rich food, health products and pharmaceutical products.

【技术实现步骤摘要】
科氏葡萄球菌S154及其在生物合成纳米硒中的应用
本专利技术涉及微生物学及生物纳米硒制备
，具体地说，涉及一种科氏葡萄球菌S154及其在生物合成纳米硒中的应用。
技术介绍
硒(Selenium,Se)元素是许多有机体必需的微量元素之一，是生物体内多种含硒酶蛋白的必需组分，并且参与人体多种代谢途径，在提高人体免疫力，抗氧化，保护肝脏、肾脏、心血管，预防糖尿病、甲状腺疾病，抗病毒，抗癌等方面具有不可或缺的作用。中国营养学会及FAO/WHO/IAEA联合专家委员会确定人体摄入量适宜范围为60-250μg/d，安全剂量为400μg/d，中毒剂量为800μg/d。人体缺硒会造成多种疾病，包括克山病、大骨节病等，并增加癌症患病风险。硒过量摄入也会对人体造成严重毒害，包括脱甲、脱发、蹒跚病等。我国具有丰富硒资源，但硒在自然界分布极不均匀，导致我国三分之二以上地区缺硒。因此亟待为缺硒人群开发安全高效硒源。硒有多种形态，包括负二价、零价、正四价、正六价等。纳米硒有别于灰色单质硒、硒化物、氧化态硒和有机硒等，是一种纳米级别红色单质硒。硒的形态不同，其生物活性和毒性差异很大。纳米硒毒性远低于无机硒和有机硒，其生物活性与有机硒无显著差异。因此开发纳米硒作为补硒源具有明显优势。国内外研究人员对微生物参与的硒的各价态间的转化及纳米硒的形成有较明确的认识。相对于化学或物理方法制备单质硒过程中的高能耗高污染，通过微生物对无机硒转化，可得到更为简便、经济、绿色环保获取单质硒的方法。近十年来，发现大约40个属细菌可以耐受硒盐，并转化硒盐为低毒的红色单质纳米硒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种科氏葡萄球菌S154及其在生物合成纳米硒中的应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术从土壤中分离得到一株可耐受极高浓度亚硒酸盐、硒酸盐的科氏葡萄球菌(Staphylococcuscohnii)S154，该菌现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNo.13328，保藏日期2016年11月22日。本专利技术还提供含有所述科氏葡萄球菌S154的菌剂或复合微生物菌剂。本专利技术还提供所述科氏葡萄球菌S154在生物合成纳米硒中的应用，向发酵培养基中添加六价和/或四价无机硒盐，发酵培养科氏葡萄球菌S154，并从发酵产物中分离纯化纳米硒。优选地，所述发酵培养基中六价无机硒盐的浓度为0.001-500mM，更优选10-400mM，例如100mM、200mM、300mM、400mM。优选地，所述发酵培养基中四价无机硒盐的浓度为0.001-400mM，更优选0.1-300mM，例如100mM、200mM、300mM。本专利技术还提供利用所述科氏葡萄球菌S154生物合成纳米硒的方法，将S154菌株活化培养，以LB培养基为发酵培养基，将OD600＝0.8-1.2的菌液按照1-5v/v％接菌量接种到发酵罐中，使发酵温度为35-39℃，搅拌速度为150-280rpm，发酵液体积：每分钟通气体积为1：0.5-3，罐压为1.0-1.4F/cm2，发酵60-150小时。前述方法还包括从发酵产物中分离纯化纳米硒的步骤；具体如下：方案I：发酵液下罐，3000-10000rpm离心10-20min收集菌体沉淀，将沉淀用无菌生理盐水洗2-3遍，并用发酵液1/30体积的水重悬沉淀，所得菌悬液经冷冻干燥，即得纳米硒干粉。方案II：a、发酵液下罐，3000-10000rpm离心10-20min收集菌体沉淀，将沉淀用无菌生理盐水洗2-3遍，并用发酵液1/30体积的水重悬沉淀，得到纳米硒悬液；b、将纳米硒悬液转移至萃取塔中，按照纳米硒悬液0.5-0.8倍体积的量加入正己烷萃取3-5次，收集下层水相，3000-5000rpm离心20-40min，所得沉淀用无菌生理盐水洗2-3遍；冷冻干燥，即得纯纳米硒干粉。本专利技术还提供利用上述方法制备的生物纳米硒。本专利技术进一步提供所述生物纳米硒在制备食品、保健品、药品、畜禽饲料以及农用肥料中的应用。本专利技术对生物纳米硒合成菌科氏葡萄球菌S154对亚硒酸盐、硒酸盐的耐受范围，对不同浓度亚硒酸盐的转化效率，不同时间点的转化效率变化，以及对其生长曲线、发酵工艺、纳米硒分离纯化技术等进行研究，获得可进行再加工的生物纳米硒。此生物纳米硒可用于富硒肥料、富硒饲料、富硒功能食品、富硒保健品以及硒药片等。本专利技术利用科氏葡萄球菌S154合成生物纳米硒，对生物纳米硒进行分离纯化，大量制备生物纳米硒。采用生物发酵工艺制备纳米硒，具有环境友好，产率高，安全高效等特点，生产获得的生物纳米硒可用于肥料、饲料、富硒功能食品、保健品及医药产品等。附图说明图1为本专利技术菌株S154系统进化树；其中，A、B、C、D、E分别为根据16SrRNA、dnaJ、hsp60、rpoB、sodA基因绘制的系统进化树。图2为本专利技术菌株S154对不同浓度亚硒酸盐的耐受性。图3为本专利技术菌株S154对不同浓度硒酸盐的耐受性。图4为本专利技术菌株S154在不同亚硒酸盐浓度下的硒产量(A)及对应浓度下的转化率(B)。图5为本专利技术菌株S154不同时间点纳米硒产量(A)和转化效率(B)。图6为本专利技术实施例6培养基中添加20mM亚硒酸盐时，S154透射电子显微镜(TEM)照片(A)和生物纳米硒能谱(EDX)分析图(B：A图箭头所指颗粒分析)。图7为本专利技术实施例7中纳米硒颗粒纯化后透射电子显微镜(TEM)照片。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1科氏葡萄球菌S154的分离纯化及鉴定1、PCR扩增16SrRNA及看家基因rpoB、dnaJ、hsp60、sodA基因序列：将菌株S154接种于LB固体培养基培养48h，取0.2mL灭菌PCR管，加入10μLddH2O，无菌牙签挑取单个菌落到PCR管中搅拌混匀。2、构建PCR反应体系并测序：16SrRNA：以8F(5’-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’)及1506R(5’-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’)为引物，PCR扩增获得16SrRNA基因序列。PCR反应体系为：ddH2O，18.5μL；10×Buffer，2.5μL，dNTPMix，2μL；引物8F，0.5μL；引物1506R，0.5μL；菌液，0.5μL；rTaq酶，0.5μL；PCR反应条件为：94℃：10min；(94℃：40s；56℃：40s；72℃：1min)×30个循环；72℃：10min；4℃；保存。rpoB：以2491F(5'-AACCAATTCCGTATIGGTTT-3')及2491R(5'-CCGTCCCAAGTCATGAAAC-3')为引物，PCR扩增获得rpoB基因序列。PCR反应体系及条件同16SrRNA序列。dnaJ：以d1(5'-CCITAY本文档来自技高网...

【技术保护点】
科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)S154，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.13328。

【技术特征摘要】
1.科氏葡萄球菌(Staphylococcuscohnii)S154，其特征在于，保藏编号为CGMCCNo.13328。2.含有权利要求1所述科氏葡萄球菌S154的菌剂或复合微生物菌剂。3.权利要求1所述科氏葡萄球菌S154在生物合成纳米硒中的应用，其特征在于，向发酵培养基中添加六价和/或四价无机硒盐，发酵培养科氏葡萄球菌S154，并从发酵产物中分离纯化纳米硒。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基中六价无机硒盐的浓度为0.001-500mM，优选10-400mM。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基中四价无机硒盐的浓度为0.001-400mM，优选0.1-300mM。6.利用权利要求1所述科氏葡萄球菌S154生物合成纳米硒的方法，其特征在于，将S154菌株活化培养，以LB培养基为发酵培养基，亚硒酸钠浓度为20mM，将OD600＝0.8-1.2的菌液按照1-5v/v％接菌量接种到发酵罐中，使发酵温度为35-39℃，搅拌速度为150-280rpm，发酵液体积：每分钟通气体积为1：0.5-...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭岩彬，李奎，张暖暖，赵桂慎，吴文良，李花粉，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11