一株枯草芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LX13，其保藏编号为CGMCC No.8805。上述的枯草芽孢杆菌LX13可以用于防治花生冠腐病、白绢病和根腐病中。与现有技术相比，本发明专利技术提供的枯草芽孢杆菌LX13对花生病原菌有明显的拮抗作用，可以作为潜力生防菌株；生防效果好，对冠腐病、白绢病和根腐病均有明显防治效果；能够显著地促进花生的生长及产量；使用方便，起效快，作用时间长，易于制备和保存，便于应用和推广。

Bacillus subtilis and its application

The invention provides a Bacillus subtilis Bacillus (subtilis LX13), whose preservation number is CGMCC No.8805. The above Bacillus subtilis LX13 can be used to control peanut crown rot, Sclerotium Blight and root rot disease. Compared with the existing technology, Bacillus subtilis LX13 has obvious antagonistic effect on the pathogen of peanut, and can be used as a potential biocontrol strain; it has good biological control effect, and has obvious control effect on crown rot, white spun disease and root rot; it can significantly promote the growth and yield of peanuts; it is convenient to use and has quick effect. Long acting time, easy to prepare and preserve, easy to apply and promote.

【技术实现步骤摘要】
一株枯草芽孢杆菌及其应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其应用。
技术介绍
花生冠腐病是花生全生育期均可发生的一种土传真菌型病害，病原为AspergillusnigerV.Tiegh，属半知菌亚门，丝孢目曲霉菌属，黑曲霉菌真菌。该病主要发生在苗期或生长前期。在花生苗期，病菌先侵染残存的子叶，进而侵染花生的茎基部。病部初生黄褐色凹陷的病斑，病斑边缘褐色，以后病部迅速扩大，皮层纵裂，组织干腐，最后仅剩下破碎的纤维组织。在潮湿的情况下，病部很快长出黑色霉层，即病菌的分生孢于梗和分生孢子。侵染果仁，能使之腐烂而不能发芽，在受害部位表面长出一层黑霉。在种仁发芽后，病菌可以侵染子叶，子叶未出土就变黑腐烂，胚轴受侵染呈水浸状，浅褐色，有黑色霉层。花生生长期感病，常造成茎基部腐烂，病株萎蔫枯死。花生白绢病是花生上的重要病害，病原为SclerotiumrolfsiiSacc.，属半知菌亚门，无孢菌目，齐整小核菌属真菌。该病多在成株期发生，高温高湿的7～9月份是发病盛期，主要危害茎基部、果柄、果荚及根。受害病组织初期呈暗褐色软腐，不久即长出白色绢丝状的菌丝，覆盖受病部位。环境条件适宜时，菌丝迅速向外蔓延，花生近地面中下部的茎杆以及病株周围的土壤表面，都可长出一层白色绢丝状的菌丝层；后期在病部菌丝层中形成很多菌核；随着受害病组织的腐烂，植株皮层脱落，仅剩下纤维组织，很易折断。荚果感病后病部变浅褐色至暗褐色，果仁感病后变皱缩腐烂，病部覆盖灰褐色菌丝层，后期还能形成菌核；病菌在种壳里面和种仁表面生长的时候还能产生草酸，以致在种皮上形成条纹、片状或圆形的蓝黑色彩纹。花生根腐病在花生各生育期均可发生，病原为半知菌亚门镰孢菌属真菌。出苗前染病可引起烂种、烂芽；在苗期受害可引起苗枯；在成株期受害可引起根腐、茎基腐和荚腐，病株地上部表现矮小、生长不良、叶片由下而上渐变黄后干枯，主根变褐、皱缩、干腐，侧根脱落，或侧根少而短，拔起时主根像老鼠尾巴一样，只留残存的根组织，俗称之“老鼠尾巴”。当前对花生病虫害的防治主要以植物抗性品种和化学防治为主，但有害生物抗性问题日益严重，且化学农药残留造成严重的危害，如残毒、环境污染，对人体和生态造成了很大威胁，不利于花生种植产业的可持续发展。因此，寻找一种经济、安全、有效的防治措施迫在眉睫。生物防治措施是利用有益微生物杀灭或者降低病原生物的数量以控制植物病害发生、发展的一类措施。这些有益生物亦称拮抗微生物或生防菌。目前有关于花生生防菌的研究，但是，针对上述三种花生病原菌的生防菌剂在应用过程中存在防效不稳定、起效慢、作用时间长、防治作用单一的问题，使得微生物菌剂的应用收到阻碍。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术旨在提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，作用于花生根际，具有非常好的防治花生冠腐病、白绢病和根腐病的效果。一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)LX13，其保藏编号为CGMCCNo.8805。上述的枯草芽孢杆菌LX13在防治花生冠腐病、白绢病和根腐病中的应用。进一步的，所述应用具体为将枯草芽孢杆菌LX13的菌液稀释后灌根。将枯草芽孢杆菌LX13制备成防治花生冠腐病、白绢病和根腐病的菌剂。上述枯草芽孢杆菌LX13在促进花生生长和产量提高方面的应用。进一步的，将草芽孢杆菌LX13的菌液稀释后灌根。与现有技术相比，本专利技术提供的枯草芽孢杆菌LX13对花生病原菌有明显的拮抗作用，可以作为潜力生防菌株；生防效果好，对冠腐病、白绢病和根腐病均有明显防治效果；能够显著地促进花生的生长及产量；使用方便，起效快，作用时间长，易于制备和保存，便于应用和推广。附图说明图1为菌株LX13的菌落形态图；图2为菌株LX13的16srDNA的PCR产物扩增结果图；图3为菌株LX13与其在GenBank数据库中相关属种构建的以16SrDNA序列为基础的系统发育树。生物材料样品保藏信息：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)LX13，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：中国，北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2014年01月22日，保藏编号CGMCCNo.8805。具体实施方式下面结合具体实施例及附图对本专利技术做进一步详细说明。以下实施例用的材料如下：分离培养基：NA培养基：牛肉浸膏(Beefextract)3g，蛋白胨(Peptone)5g，葡萄糖(Dextrose)10g，琼脂粉(Agar)15g，蒸馏水1000mL，调pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。种子培养基：LB液体培养基，成分：胰蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，氯化钠(NaCl)10g，蒸馏水1000mL，调pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。真菌培养基：PDA培养基，成分：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。实验真菌来源：山东省花生研究所保存花生冠腐病、白绢病菌和花生根腐病菌。实施例1菌株的分离、培养和鉴定1、菌株的筛选和分离挑取平板上的一批单菌落于LB固体培养基平板上画线倒置于28℃恒温培养箱培养1-2天。土壤来自山东省花生研究所实验田花生根际土壤。称取5g根际土壤放入45ml无菌水的三角瓶中，摇动片刻，吸取上层液0.5ml加入到含有4.5ml无菌水试管中，按照102、103、104、105、106的倍数进行梯度稀释。用微量移液器分别吸取不同稀释倍数的土壤悬液100μl于NA平板上，灭菌涂布器涂布均勾，将平板封口后倒置于28℃恒温培养箱中培养48h。挑取平板上的一批单菌落于LB固体培养基平板上画线倒置于28℃恒温培养箱培养1-2d。2、菌落的形态观察及菌株的生理生化鉴定生防细菌菌株LX13在LB平板上生长，乳白色，表面干燥有皱褶，无光泽，不光滑，菌落边缘不规则呈锯齿状，如图1所示；菌株LX13在澄清的LB液体培养基中，振荡培养，表面不形成膜层，菌悬液浑浊。革兰氏染色、V-P测定、接触酶试验、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、甲基红试验等参照《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化鉴定。LX13菌株的生理生化鉴定结果见表1，结果显示LX13菌体表现为革兰氏阳性、好氧菌；甲基红、接触酶和V-P反应呈阳性；能以柠檬酸盐作为碳素的营养来源，能够还原硝酸盐，水解酪蛋白、淀粉和明胶；并能将糖醇发酵产生酸，但不产生吲哚。根据以上形态特征和生理生化特性，并结合伯杰氏细菌鉴定手册和常见细菌系统鉴定手册，生防细菌菌株LX13与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)十分接近。表1活性菌株LX13的生理生化特征注：“+”表示反应结果为阳性；“－”表示反应结果为阴性。3、细菌的16SrRNA分子学鉴定菌株DNA提取选取对真菌具有拮抗活性的细菌菌株，挑取10个相同的菌落做重复，进行基因组DNA的提取，其提取方法主要参照TIANGENTIANampBACTERiaDNAKit试剂盒说明书进行，并略加修改，步骤如下：(1)取细菌培养液1mL，10000rpm离心1min，尽量吸净上清；(2)向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，震荡至本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LX13，其保藏编号为CGMCC No.8805。

【技术特征摘要】
1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)LX13，其保藏编号为CGMCCNo.8805。2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌LX13在防治花生冠腐病、白绢病和根腐病中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用具体为将枯草芽孢杆菌LX13的菌液稀...

【专利技术属性】
技术研发人员：迟玉成，张霞，许曼琳，吴菊香，董炜博，王磊，陈殿绪，于建垒，刘同金，鄢洪海，梁晨，张茹琴，
申请(专利权)人：山东省花生研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37