一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2及其筛选方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2及其筛选方法与应用，该菌株分类命名是Enterococcus faecium XC2，该菌株于2016年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：M2016297。该菌株筛选自猪粪便样品，在KF链球菌琼脂培养基呈红色、光滑凸起、周边整齐的菌落，在MRS琼脂培养基上呈乳白色、边缘光滑、直径1mm的菌落，镜检呈卵圆形，单个、成双或短链排列，革兰氏染色呈蓝色。本发明专利技术菌株对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌均有明显抑制作用，其产生肠球菌素B，解决了抗生素造成畜禽肠道菌群紊乱、动物抗病力下降以及不合理遵守休药期导致的畜产品药物残留的问题。

Enterococcus faecium XC2 producing bacteriostatic substance and its screening method and Application

The invention discloses a bacteriostat producing Enterococcus faecium XC2 and its screening method and application. The strain is named Enterococcus faecium XC2, which was preserved in China's typical culture storage center (CCTCC) in May 31, 2016, and its preservation number is CCTCC NO: M2016297. The strain was selected from the pig feces samples. The colony of KF Streptococcus agar was red, smooth and protruded. The colonies were white, smooth, and 1mm in diameter on the MRS agar medium. The colonies were oval, single, double or short chain, and blue in Gram stain. The strain of the invention has obvious inhibitory effect on Staphylococcus aureus, Salmonella and Escherichia coli, which produces enterococci B, which solves the problem of antibiotic residues in livestock products caused by the disorder of the intestinal flora of the livestock and poultry, the decline of the animal resistance to the animal and the unreasonable compliance with the period of the drug break.

【技术实现步骤摘要】
一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2及其筛选方法与应用
本专利技术属于抗生素替代
，涉及一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2及其筛选方法与应用。
技术介绍
抗生素作为生长促进剂(3.Dibner,J.andJ.Richards.Antibioticgrowthpromotersinagriculture:historyandmodeofaction.Poultryscience,2005,84(4):634-643)以亚剂量水平添加到畜禽日粮中，极大的推动了畜牧业和饲料工业的发展。然而临床上对抗生素大规模且不合理的使用给畜禽养殖业带来了严重问题，如耐药菌株不断增加，畜禽肠道菌群紊乱，动物抗病力下降，以及不合理遵守休药期导致的畜产品药物残留以及环境污染，同时给新型的健康生态养殖模式带来了巨大挑战。WHO限制欧盟使用抗生素以后，越来越多的国家通过立法措施禁止抗生素的滥用。近年来，我国也开始逐步限制抗生素在饲料中的应用，“无抗养殖”将成为必然趋势。因此，探索具有促生长和健康调节功能的抗生素替代品十分迫切，例如有机酸、酶制剂、寡聚糖、中草药、益生菌。其中益生菌作为抗生素的替代物质(Shanahan,F.andJ.McCarthy.Functionalfoodsandprobiotics:timeforgastroenterologiststoembracetheconcept.Currentgastroenterologyreports,2000,2(5):345-346；Park,Y.-S.,J.-Y.Lee,Y.-S.KimandD.-H.Shin.Isolationandcharacterizationoflacticacidbacteriafromfecesofnewbornbabyandfromdongchimi.Journalofagriculturalandfoodchemistry,2002,50(9):2531-2536)在饲料中添加，不仅具有调节宿主胃肠道平衡，提高畜禽日增重和防治腹泻的功能，而且还具有无污染、无耐药性和无药物残留的优点。屎肠球菌是人和动物体内正常菌群的一部分，具有生长速度快、粘附力高的特点，作为活菌制剂已成功应用在畜牧水产养殖业领域。尽管肠球菌在食品中的安全应用已有多年的历史，但其抑菌机制一直不明确，研究表明该菌产生肠球菌素可抑制其他致病菌生长和繁殖，具有良好的应用前景。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对抗生素造成畜禽肠道菌群紊乱、动物抗病力下降、以及不合理遵守休药期导致的畜产品药物残留以及环境污染的问题，提供了一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2及其筛选方法与应用。本专利技术公开了一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2，抑菌物质为细菌素，所述菌株的分类命名是EnterococcusfaeciumXC2，该菌株于2016年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCCNO：M2016297。本专利技术还公开了一种上述的产抑菌物质的屎肠球菌XC2在制备抑制致病性大肠杆菌K88的黏附药物中的应用。本专利技术还公开了一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2的筛选方法，具体按照以下步骤实施：步骤1、样品采集及培养；步骤2：菌株抑菌能力筛选，并传代保存；步骤3、属的鉴定，最终筛选出产肠球菌素屎肠球菌XC2。进一步地，所述步骤1具体过程为：样品取自健康猪粪便，样品采集后，用棉拭子在KF链球菌琼脂培养基中划线培养，37℃、24h～48h培养后，选取红色，光滑凸起，周边整齐，1mm左右大小的菌落做纯培养，将纯培养物在MRS琼脂培养基上培养。进一步地，所述步骤2具体过程为：对纯化后的菌株进行发酵培养，用牛津杯法筛选对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌有抑制作用的菌株，均传代保存。进一步地，所述步骤3具体过程为：将上述分离的菌株进行6.5％NaCl生长试验、pH9.6肉汤生长试验、45℃生长试验、60℃，30min生长试验、胆汁-七叶苷水解试验，能耐受6.5％NaCl、在pH9.6肉汤中生长、45℃能存活、60℃作用30min能存活、胆汁-七叶苷水解阳性的菌株即定为肠球菌属细菌。本专利技术还公开了一种如上所述的抑菌物质，该抑菌物质种类为肠球菌素B。本专利技术还公开了一种如上所述的肠球菌素B对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌抑菌的应用。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：(1)本专利技术菌株对常见肠道致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌)具有明显的抑菌效果，为替代抗生素添加剂提供了有力依据；(2)本专利技术用毒力因子检测、抗生素敏感性检测以及急性口服毒性试验评价益生菌株，充分保证其安全性；(3)该菌株生长繁殖速度快，适合于工业化生产；(4)菌株可完全耐受胃酸及肠道胆盐高渗透压环境，且具有高粘附力，因此可在肠道定植发挥益生功能；(5)该菌株虽然不产芽胞，但对高温的耐受能力相对较强，可耐受70℃高温。这为该菌株作饲料添加剂的应用于生产实际打下了良好基础。(6)该菌株产抑菌物质，经鉴定该抑菌物质为肠球菌素B；(7)该肠球菌素B对常见肠道致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌)具有明显的抑菌效果。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术分离筛选的屎肠球菌株在MRS琼脂平板上的生长状态；图2是本专利技术分离筛选的屎肠球菌株革兰氏染色阳性反应(×2000)；图3是本专利技术肠球菌素B基因PCR扩增检测结果，其中，M:DL2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照，泳道2：本专利技术菌株；图4是本专利技术屎肠球菌的种特异性基因ddlE.faecium的PCR扩增检测结果；其中，M:DL2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照，泳道2：阳性对照，泳道3：本专利技术菌株；图5是本专利技术不同肠球菌素的PCR扩增检测结果；其中，M:DL2000DNA分子量标准，1：enterocinA，2：enterocinL50A，3：enterocinL50B，4：enterocinP，5：enterocinQ，6：enterocinB，7：enterocinAS-48；图6是本专利技术菌株的毒力基因检测中esp、as、cylA、ace、gelE、efaAfm的PCR产物检测，其中，(a)是本专利技术菌株的毒力基因检测中esp的PCR产物检测，其中，M:DL2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照，泳道2：阳性对照，泳道3：本专利技术菌株；(b)是本专利技术菌株的毒力基因检测中as的PCR产物检测，其中，M:DL2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照，泳道2：阳性对照，泳道3：本专利技术菌株；(c)是本专利技术菌株的毒力基因检测中cylA的PCR产物检测，其中，M:DL2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照，泳道2：阳性对照，泳道3：本专利技术菌株；(d)是本专利技术菌株的毒力基因检测中ace的PCR产物检测，其中，M:DL2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照，泳道2：阳性对照，泳道3：本专利技术菌株；(e)是本专利技术菌株的毒力基因检测中gelE的PCR产物检测，其中，M本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2，其特征在于，抑菌物质为细菌素，所述菌株的分类命名是Enterococcus faecium XC2，该菌株于2016年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：M2016297。

【技术特征摘要】
1.一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2，其特征在于，抑菌物质为细菌素，所述菌株的分类命名是EnterococcusfaeciumXC2，该菌株于2016年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCCNO：M2016297。2.权利要求1所述的产抑菌物质的屎肠球菌XC2在制备抑制致病性大肠杆菌K88的黏附药物中的应用。3.一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2的筛选方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：步骤1、样品采集及培养；步骤2：菌株抑菌能力筛选，并传代保存；步骤3、属的鉴定，最终筛选出产肠球菌素屎肠球菌XC2。4.根据权利要求3所述的一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2的筛选方法，其特征在于，所述步骤1具体过程为：样品取自健康猪粪便，样品采集后，用棉拭子在KF链球菌琼脂培养基中划线培养，37℃、24h～48h培养后，选取红色，光滑凸起，周边整齐，1mm左右大...

【专利技术属性】
技术研发人员：王喜亮，贺宇成，李越，李晓飞，金秀娥，周祖涛，肖运才，毕丁仁，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42