一种稳定型乳酸菌微生态制剂的制备方法技术

本发明专利技术提出了一种稳定型乳酸菌微生态制剂的制备方法，属于乳酸菌发酵领域。它以养殖动物、养殖水体和底泥为菌源分离出乳酸菌菌株；然后将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出2‑5株溶钙圈大，生长快，活力强的乳酸菌菌株；接着将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液；最后将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂，与现有技术相比，本发明专利技术的有益效果是它是一种培养设备及操作都很简单，而且储存时间和单一菌株发酵水剂相比很稳定的乳酸菌微生态制剂的制备方法。

Preparation method of a stable Lactobacillus microecological preparation

The invention provides a method for preparing a stable Lactobacillus microecological preparation, belonging to the field of lactic acid bacteria fermentation. The lactobacillus strain was isolated from the cultured animals, aquaculture water and sediment, and then the isolated strains of lactic acid bacteria were purified and selected to produce 2 strains of lactic acid bacteria with large, fast growth and strong vitality. Then, the strains of lactic acid bacteria were expanded to grow and prepare compound seed liquid. Then the compound seed liquid was inoculated and fermented to obtain the compound lactic acid bacteria microecological preparation. Compared with the existing technology, the beneficial effect of the invention is that it is a kind of simple culture equipment and operation, and the preparation method of lactic acid bacteria microecological preparation is very stable compared with the storage time and the single strain fermented water agent.

【技术实现步骤摘要】
一种稳定型乳酸菌微生态制剂的制备方法
本专利技术涉及乳酸菌发酵领域，特别涉及一种稳定型乳酸菌微生态制剂的制备方法。
技术介绍
随着水产养殖业的迅猛发展，乳酸菌制剂以其天然、无毒、无副作用、无污染、无残留、安全可靠的优越性越来越受到重视。作为一种有益的净化水质的“生物修复剂”，乳酸菌制剂在水产养殖业的应用越来越受到重视，其应用于水产养殖业主要集中于拌料投喂、发酵饲料及作为EM菌主导菌在水体泼洒。其中拌料投喂、发酵饲料研究集中于乳酸菌在水产动物肠胃栖息，及调节动物肠道菌群结构和对饲料结构的改变。泼洒调节水质与乳酸菌可以调节养殖水体、改善养殖环境，抑制病原菌，抗病害，提高免疫力、促进动物生长有着密切的关系。这些应用与乳酸菌以下特性关系密切：首先，乳酸菌能很好适应水产养殖环境。水产养殖在养殖期间环境温度变动范围为20-35℃、盐度变动范围为0-38、pH值变动范围为6.9-8.7，在这三者变动范围内乳酸菌均能较好生长。其次，乳酸菌大部分的菌种属耐氧性厌氧菌，在无氧、低氧或高氧条件下均生长，不仅不与养殖动物竞争氧气，而且还能在溶氧量较低的水体中下层大量生长繁殖，抑制病原菌滋生。另外，乳酸菌在使用上不受时间限制，暴雨、阴天、晴天、高温条件下都可以使用。此外，乳酸菌作为一种最早使用的益生菌，与其它菌种相比，其菌体和代谢产物都为有益物，无毒素，实际应用中具有较高的安全性。这些乳酸菌在水产上的应用上的这些优势使得乳酸菌在水产方面有着广泛的应用和研究。但是，目前大部分的乳酸菌类微生态制剂包被的产品价格昂贵，使用成本非常高；而乳酸菌类微生态制剂水剂产品相对较便宜，但是大多数产品很不稳定，活菌数较低，储存周期很短，而且运输成本较高；固体和液体乳酸菌类微生态制剂产品目前大多数采用发酵罐进行发酵，一方面生产工艺要求严格，需要专业的技术人员才能操作；另一方面，发酵罐的成本较高。
技术实现思路
本专利技术提出了一种稳定型乳酸菌微生态制剂的制备方法，解决了现有技术中的不足，是一种培养设备及操作都很简单，而且储存时间和单一菌株发酵水剂相比很稳定的乳酸菌微生态制剂的制备方法。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种稳定型乳酸菌微生态制剂的制备方法，以养殖动物、养殖水体和底泥为菌源，通过在MRS液体培养基中富集后涂布固体MRS培养基分离出乳酸菌菌株；然后将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出2-5株溶钙圈大，生长快，活力强的乳酸菌菌株；接着将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液；最后将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂。进一步的，所述纯化选育出的乳酸菌菌株为四株。其中，所述的乳酸菌菌株进行纯化采用灭菌的MRS液体培养基，进行富集培养，将富集的菌液涂于MRS斜面上，分离出在含碳酸钙的MRS固体培养基上溶钙圈大的菌株若干株，经过两次分离纯化后待用；将分离纯化后的若干株乳酸菌菌株分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，在30℃-37℃温度下培养46-50小时后吸取菌液在5000rpm下离心10-15min，弃去上清液保留菌体，向菌体中注入95%的生理盐水得到稀释菌液，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液OD543mn的吸光度，当所有稀释菌液的吸光度值相同时，一般吸光度在0.8-1.2之间时，把所有的稀释菌液按相同的体积比3-5%分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，30℃-37℃下静置培养24-48h，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液的OD543nm，选出8-12株的OD543nm测定值高的菌株，这个OD543nm测定值在0.5-1.0之间；然后把这些菌株的培养液在室温下继续放置10天，后用MRS固体培养基进行平板计数，培养时间为24-48h,温度为30℃-37℃，选出计数结果高的菌株，最终选出四株乳酸菌菌株分别保种，一般计数结果的活菌数在109CFU/mL都可以进行保种。上述MRS液体培养基的重量份组成为：大豆蛋白胨0.5-1.5份，牛肉膏0.5-1.5份，酵母浸粉0.2-0.6份，葡萄糖1.5-2.5份，磷酸氢二钾0.1-0.3份，乙酸钠0.3-0.7份，柠檬酸三铵0.1-0.3份，硫酸镁0.05-0.06份，硫酸锰0.02-0.03份，吐温0.05-0.15份，蒸馏水99-101份。上述的含碳酸钙的MRS固体培养基是在MRS液体培养基中按蒸馏水的重量加入1.5-1.8%的琼脂粉和1-1.2%的碳酸钙。其中，所述的将进行纯化选育后选出的四株乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液为：将四株来源不同的乳酸菌菌株进行平板划线，进行平板划线所用的培养基为MRS固体培养基，灭菌后冷却至44-46℃在超净台中倒入平板中，待平板冷却凝固后按10倍梯度稀释法进行平板涂布计数，并观察杂菌。挑取单菌落接入灭菌的MRS液体培养基中进行扩大培养，在30℃-37℃下培养36h-48h，然后将四种培养液按体积比例10%，30%，30%，30%混合，然后接种于灭菌的MRS液体培养基中，接种量为5-20%，在30℃-37℃下混合培养24-48h获得复合种子液。其中，所述的将复合种子液接种发酵为：将复合种子液接种到液体发酵培养基中，待搅拌均匀后密封在室温下发酵3-5天，在密封发酵过程中每天搅拌两次，并释放气体，同时在发酵过程中抽样1-2次，用平板计数法观察菌体的生长及杂菌率，并且测定pH值，当活菌数到达5×108CFU/mL,杂菌率≦5%，pH值在3.0-4.0的条件下停止发酵，即得复合型乳酸菌微生态制剂。上述的液体发酵培养基的重量份组成为：蔗糖0.5-1份，酵母膏0.2-0.5份，乙酸钠0.2-0.5份，磷酸氢二钾0.05-1份，柠檬酸三铵0.1-0.5份，硫酸镁0.058-0.065份、硫酸锰0.020-0.025份，吐温0.05-0.1份，蒸馏水99-101份。进一步的，上述的液体发酵培养基的重量份组成为：蔗糖0.8份，酵母膏0.4份，乙酸钠0.3份，磷酸氢二钾0.5份，柠檬酸三铵0.3份，硫酸镁0.06份、硫酸锰0.023份，吐温0.08份，蒸馏水100份。上述液体发酵培养基的制备方法为：将酵母膏按比例加入自来水中蒸煮，待水开后继续蒸煮5分钟，后加入余下的成分，溶解完全后倒入消毒的塑料桶中冷却待用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术从水产养殖动物肠道、养殖水体和底泥中筛选乳酸菌，通过不断地纯化，筛选到生长速度高，产酸能力强，温度适应范围宽的多株菌株进行复配发酵，发酵液含有比单菌株发酵更多的代谢产物及风味物质，通过复配发酵，菌株之间互相影响，形成的菌液稳定性更高，活性更好，储存时间更长。通过养殖试验发现，复合发酵液拌料对鱼类具有较好的诱食作用，同时提高养殖动物的免疫力。此外，用该复合乳酸菌发酵液泼洒养殖水体，发现对水质指标具有明显的改善作用，泼洒复合发酵液的氨氮的降低幅度是35.56%，而对照组的氨氮增加了45.49%，而泼洒复合发酵液的亚硝酸盐的降低幅度是对照组的2倍。（1）采用由多种不同来源形态不同的乳酸菌复配而成，形成了具有多样性、复杂而又稳定的乳酸菌群落，各个菌株能互利共存，优势互补，协同发挥作用，功能强大，在养殖水体中使用对水质指标的改善效果更好，是单一的乳酸菌制剂所无法实现的。（2）本专利技术最大的特点是采用了简易的发酵设备，简易的发酵设备不但可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：它以养殖动物、养殖水体和底泥为菌源分离出乳酸菌菌株；然后将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出2‑5株溶钙圈大，生长快，活力强的乳酸菌菌株；接着将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液；最后将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂。

【技术特征摘要】
1.一种稳定型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：它以养殖动物、养殖水体和底泥为菌源分离出乳酸菌菌株；然后将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出2-5株溶钙圈大，生长快，活力强的乳酸菌菌株；接着将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养，制备复合种子液；最后将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂。2.根据权利要求1所述的一种稳定型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述纯化选育出的乳酸菌菌株为四株。3.根据权利要求2所述的一种稳定型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述的乳酸菌菌株进行纯化采用灭菌的MRS液体培养基，进行富集培养，将富集的菌液涂于MRS斜面上，分离出在含碳酸钙的MRS固体培养基上溶钙圈大的菌株若干株，经过两次分离纯化后待用；将分离纯化后的若干株乳酸菌菌株分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，在30℃-37℃温度下培养46-50小时后吸取菌液在5000rpm下离心10-15min，弃去上清液保留菌体，向菌体中注入95%的生理盐水得到稀释菌液，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液OD543mn的吸光度，当所有稀释菌液的吸光度值相同时，把所有的稀释菌液按相同的体积比3-5%分别接种于灭菌的MRS液体培养基中，30℃-37℃下静置培养24-48h，然后用紫外分光光度计测定稀释菌液的OD543nm，选出的OD543nm测定值高的菌株；然后把这些菌株的培养液在室温下继续放置10天，后用MRS固体培养基进行平板计数，培养时间为24-48h,温度为30℃-37℃，选出计数结果高的菌株，最终选出4株乳酸菌菌株分别保种。4.根据权利要求3所述的一种稳定型乳酸菌微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述MRS液体培养基的重量份组成为：大豆蛋白胨0.5-1.5份，牛肉膏0.5-1.5份，酵母浸粉0.2-0.6份，葡萄糖1.5-2.5份，磷酸氢二钾0.1-0.3份，乙酸钠0.3-0.7份，柠檬酸三铵0.1-0.3份，硫酸镁0.05-0.06份，硫酸锰0.02-0.03份，吐温0.05-0.15份，蒸馏水99-101份。5.根据权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：郑州神草生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41