本发明专利技术公开了一种从TNT红水污染土壤中分离细菌来降解红水中的主要污染物2，4‑二硝基甲苯‑3‑磺酸盐(2，4‑DNT‑3‑SA)和2，4‑二硝基甲苯‑5‑磺酸盐(2，4‑DNT‑5‑SA)的方法。先采集TNT红水污染土壤，将土壤中的细菌富集、分离、纯化培养，筛选出一种高效降解菌株X1，保藏单位名称为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.14587。该降解菌株对土壤中的2，4‑DNT‑3‑SA和2，4‑DNT‑5‑SA具有非常好的降解效果，对500mg/kg的2，4‑DNT‑3‑SA和2，4‑DNT‑5‑SA的降解率达到100％。
A strain of 2,4- two nitrotoluene sulfonate degrading bacteria and its application
The invention discloses a method for separating bacteria from TNT red water contaminated soil to degrade the main pollutants of red water 2, 4, two nitrotoluene 3 sulfonates (2, 4, 3, 3, 3) and 2, 4 two nitrotoluene 5 sulfonates (2, 4 DNT 5 5 SA). The TNT red water contaminated soil was collected, the bacteria in the soil were enriched, separated and purified, and a highly efficient degradation strain X1 was screened out. The name of the preservation unit was the management center of the Chinese common microbial species preservation, and the preservation number was CGMCC NO.14587. The degradation strain has a very good degradation effect on 2, 4, DNT, 3, 3, 2, 4, 5, 5, 2, 4, DNT, 3, 3 SA and 2, 4, DNT, DNT, 2, and 2, 4, DNT, SA, to 100%.
【技术实现步骤摘要】
一株2,4-二硝基甲苯磺酸盐降解菌株及其应用
本专利技术属于环境生物领域，具体涉及一株TNT红水污染土壤降解菌株，及其在TNT红水和TNT红水污染土壤修复中的应用。
技术介绍
2,4,6-三硝基甲苯(TNT)是一种军事爆炸品，已经使用了50多年。在生产过程中，产生大量称为红水的废水，TNT红水含30余种硝基芳香化合物包含二硝基甲苯磺酸盐(DNTS)，TNT，二硝基甲苯(DNT)，硝基甲苯(MNT)等硝基苯衍生物，其主要污染物是2,4-二硝基甲苯-3-磺酸钠(2，4-DNT-3-SO3Na)和2,4-二硝基甲苯-5-磺酸钠(2，4-DNT-5-SO3Na)。TNT红水成分复杂，色度高，COD大，毒性强，难以生物降解，对生态环境和人类健康存在很大的危害，因此国家明令禁止直接排放TNT红水。TNT红水及TNT红水污染土壤的处理是TNT生产中必须解决的环境问题。以前关于TNT红水处理的研究集中在吸附，湿空气氧化和焚烧。然而，这些方法并不具有成本效益。此外真空蒸馏和活性焦炭处理TNT红水也有研究。TNT红水中大多数化学需氧量(COD)和DNTs可以通过真空蒸馏和活化焦炭除去，但是残留的馏分和饱和活性焦炭是有害的废物需要进一步处理。同时，针对TNT红水污染土壤的处理鲜有研究。土壤生物修复技术发源于20世纪80年代，与物理和化学法相比，生物修复技术具有成本相对较低、操作简单、不易造成二次污染、能实施原位处理等优点，因而受到各国学术界、工业界和政府部门的高度重视，是当前土壤修复技术研究领域的前沿，且具有实际应用价值。虽然环境中存在诸多微生物，但可以利用二硝基甲苯磺酸盐作为碳源和能源的并不多。尚未有研究指出在土壤中分离出可以降解二硝基甲苯磺酸盐的微生物。本专利技术从土壤中分离出一株可以降解二硝基甲苯磺酸盐的工程菌株并将其制成菌液，投加到TNT红水污染土壤中进行土壤修复。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株2,4-二硝基甲苯磺酸盐降解菌株并将其应用于TNT红水污染土壤。为实现上述专利技术的目的，本专利技术的技术方案为：一种硝基化合物降解菌株，其特征在于，所述菌株为芽孢杆菌属(Bacillussp.)，于2017年9月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCCNO.14587。一种如上所述的从TNT红水污染土壤中分离高效降解菌株来降解2，4-二硝基甲苯磺酸盐的方法，其特征在于具体按照以下步骤实施：取TNT红水污染土壤10g放入装有100mlLB液体培养基的锥形瓶中，在30℃、120rpm的恒温摇床上进行震荡，富集培养24h，所述LB培养基的组分为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL。24h后取1ml培养液用涂布棒涂布到含有2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA的固体无机盐培养基中，放入恒温培养箱培养7d；所述含2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA无机盐固体培养基的组分为：2，4-DNT-3-SA0.5g，2，4-DNT-5-SA0.5g，NaCl30g，NH4NO33g，KH2PO41g,K2HPO41g,CaCl20.02g,MgSO40.5g，琼脂粉20g；去离子水1L；微量元素溶液10ml。微量元素溶液：CuSO40.05g，MnSO40.05g,FeSO4.7H2O0.05g，去离子水50ml。待菌落长出后，观察菌落形态，用无菌接种环从上述固体无机盐培养基中挑选形态差距大的菌落，采用平板划线分离法接种于LB固体培养基上，置于恒温培养箱中30℃倒置培养24h，待菌落长出后挑取单菌落，并以同样的方法接种至LB固体培养基。重复上述划线分离过程，直至形成形态单一的纯化菌落。上述菌株的菌落形态为：菌落呈白色，菌落表面褶皱干瘪，边缘形态不规则，如图1。菌体呈短杆状，细菌形态见扫描电镜图2。上述菌株的16SribosomalRNA基因序列特征，采用分析法将序列与数据库进行比对分析，发现该菌株属于芽孢杆菌属(Bacillussp.)，其DNA序列表如序列表所示。使用前将其在LB液体培养基中活化24h制成菌液，将菌液以2％的接种量接种于TNT红水污染土壤中。优选的，所述的降解的最佳条件为：10％的接种量，温度40℃，pH为9的条件下降解效果最佳。附图说明图1为菌株X1的群落形态图2为菌株X1的扫描电镜图图3Bacillussp.X1实验室工况下对两种2，4-二硝基甲苯磺酸盐的降解曲线。图4Bacillussp.X1在不同pH下对两种2，4-二硝基甲苯磺酸盐的降解率。图5Bacillussp.X1在不同温度下对两种2，4-二硝基甲苯磺酸盐的降解率。具体实施方式为了更好地理解本专利技术，下面结合实施例对本
技术实现思路
进行进一步详细说明，但本专利技术的内容不仅仅局限于下面的实施例。一种二硝基甲苯磺酸盐降解菌株，菌株为微杆菌属(一)材料准备从甘肃某地取回TNT红水污染土壤，4℃保存，运回实验室后将其接种到LB培养基中进行活化2.培养基：含2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA无机盐固体培养基的组分为：2，4-DNT-3-SA0.5g，2，4-DNT-5-SA0.5g，NaCl30g，NH4NO33g，KH2PO41g，K2HPO41g，CaCl20.02g，MgSO40.5g，琼脂粉20g；去离子水1L；微量元素溶液10ml。微量元素溶液：CuSO40.05g，MnSO40.05g,FeSO4.7H2O0.05g，去离子水50ml。LB固体培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、琼脂粉20蒸馏水1000mL，调节pH为73.实验仪器和设备恒温振荡器电热恒温培养箱高压灭菌锅,UV-1750紫外可见分光光度计-----上海棱光技术有限公司,超净工作台,PCR仪。(二)菌株的分离筛选与驯化取TNT红水污染土壤10g放入装有100mlLB液体培养基的锥形瓶中，在30℃、120rpm的恒温要床上进行震荡，富集培养24h，24h后取1ml培养液用涂布棒涂布到含有2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA的固体无机盐培养基中，放入恒温培养箱培养7d；待菌落长出后，观察菌落形态，用无菌接种环从上述固体无机盐培养基中挑选形态差距大的菌落，采用平板划线分离法接种于LB固体培养基上，置于恒温培养箱中30℃倒置培养24h，待菌落长出后挑取单菌落，并以同样的方法接种至LB固体培养基。重复上述划线分离过程，直至形成形态单一的纯化菌落。将单菌落在液体LB培养基中扩繁，并保存在4℃，备用。使用前将保存的菌株在LB液体培养基中活化。下面为具体实施例部分。实施例1：模拟TNT红水污染土壤修复试验取未污染土壤，风干研磨、过1mm筛，备用。称取一定量的2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA溶于丙酮中。在通风橱中，向上述土壤中均匀喷洒两种磺酸盐的丙酮溶液，并搅拌均匀。使土壤浓度约为2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA的浓度各为500mg/kg；在通风橱中使其自然风干2天。挑取单菌落于灭菌的LB液体培养基中，用透气封口膜封口，将锥形瓶置于摇床中于120rpm、30℃活化24本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种2,4‑二硝基甲苯降解菌株，其特征在于，所述菌株为芽孢杆菌属Bacillus sp.X1，保藏单位名称为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.14587。
【技术特征摘要】
1.一种2,4-二硝基甲苯降解菌株，其特征在于，所述菌株为芽孢杆菌属Bacillussp.X1，保藏单位名称为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNO.14587。2.一种如权利要求1所述的一种2,4-二硝基甲苯降解菌株的应用，所述应用为在TNT红水和TNT红水污染土壤修复中的应用。3.如权利要求2所述的应用，所述应用具体为：挑取Bacillussp.X1单菌落于含LB培养基的锥形瓶中，于40℃，120rpm条件下培养1d，制成种子培养液。将上述培养的种子液按5％的接种量接种于含LB培养基发酵罐进行培养，采用空气压缩机进行曝气，搅拌转...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶正芳，徐文杰，李智林，
申请(专利权)人：北京协同创新研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11
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