本发明专利技术提供MG53多聚体及MG53突变体的多聚体，同时还提供这些MG53多聚体或MG53突变体的多聚体的其制备纯化方法。这种MG53多聚体或MG53突变体的多聚体主要由MG53二聚体组成。研究发现，这些MG53多聚体或MG53突变体的多聚体可用于预防或治疗与细胞膜损伤相关疾病，例如与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤等。
A method for the preparation of MG53 polypolymerization system and its use
The present invention provides polymers of MG53 polymers and MG53 mutants, and provides a method for the preparation and purification of the polymers of these MG53 polymers or MG53 mutants. The MG53 polymers or MG53 mutants are mainly composed of MG53 two polymers. It has been found that these polymers of MG53 polymers or MG53 mutants can be used to prevent or treat diseases related to cell membrane damage, such as diseases associated with cardiomyocyte injury, ulcer related diseases, wounds, especially wounds, intestinal fistula, and kidney injury.
【技术实现步骤摘要】
一种MG53多聚体制备方法及其用途专利
本专利技术涉及MG53多聚体或MG53突变体的多聚体以及它们的制备方法。同时本申请还涉及该MG53多聚体或MG53突变体的多聚体在预防或治疗与细胞膜损伤相关疾病中的用途，例如与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤等。与心肌细胞损伤相关的疾病可包括选自与以下症状相关的疾病中的一种或多种：心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常和心脏破裂等。与溃疡相关疾病包括选自以下疾病的一种或多种：慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡。与肾损伤相关疾病选自一下疾病的一种或多种：肾病综合征，肾前性、肾性和肾后性的急性肾损伤，慢性肾衰竭。相比于MG53单体，MG53多聚体或MG53突变体的多聚体在能更好地保护心脏、治疗细胞死亡导致的心脏疾病的同时，还避免了同样具有心脏保护功效的MG53同时伴有的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。并且相对于MG53单体，这种MG53多聚体或MG53突变体的多聚体在溃疡，尤其是慢性溃疡和消化性溃疡，例如糖尿病足溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡的治疗中更加有效。专利技术背景MG53是骨骼肌特异性蛋白mitsugumin53，简称MG53或TRIM72。MG53是一种肌肉特异性tripartitemotiffamily(TRIM)家族蛋白。该家族蛋白常含三个特定基序结构，分别称为RING，B-BOX和卷曲结构域(Coiledcoil结构域)。它们共同作用结合在细胞不再需要的蛋白质上，将这些蛋白质带上泛素标记以便降解。MG53也是细胞膜修复机制的重要组成部分。在医学应用方面，MG53治疗由细胞凋亡引起的心脏疾病的功效已被接受并且是本领域技术人员公知的。MG53能够对心脏产生保护作用，也就是说可以通过增加MG53的含量保护心脏损伤。但是，MG53同时存在着不可忽视并被视为一大危害的负面效果，即增加含量的MG53在保护心脏的同时，会引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征。也就是说MG53在保护心脏的同时，伴有胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病等副作用。这种副作用是业内所关心的且不希望的，至今没有解决渠道。研究显示，在自然条件下和细胞内部MG53均是以单体存在，而对MG53多聚体的研究比较少。专利技术概述本专利技术提供MG53多聚体或MG53突变体的多聚体及它们的制备方法。这种MG53多聚体或MG53突变体的多聚体通过真核生物细胞表达。这种MG53多聚体或MG53突变体的多聚体主要由MG53二聚体的形式组成。研究发现，这种MG53多聚体或MG53突变体的多聚体可用于预防或治疗与细胞膜损伤相关疾病，例如与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤等。与心肌细胞损伤相关的疾病可包括选自与以下症状相关的疾病中的一种或多种：心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常和心脏破裂等。与溃疡相关疾病包括选自以下疾病的一种或多种：慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病腿部溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡等。特别地，申请人发现相比于MG53单体，MG53多聚体或MG53突变体的多聚体在能更好地保护心脏、治疗细胞死亡导致的心脏疾病的同时，还能避免具有心脏保护功效的MG53单体同时伴有的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。并且，相比于MG53单体，MG53多聚体或MG53突变体的多聚体在溃疡，例如慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病腿部溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡的治疗中更加有效。MG53能够对心脏产生保护作用，也就是说可以通过增加MG53的含量保护心脏损伤。但之后发现，增加量的MG53的在保护心脏的同时，会引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征。也就是说MG53在保护心脏的同时，伴有胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。为促进MG53蛋白功能的优化，本申请进行大量的科研工作对MG53蛋白进行优化，其中一个目的是希望能在不引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用等前提下，使MG53蛋白保留心脏保护功能，但不伴随相应的副作用。本专利技术提供一种MG53多聚体，其中主要是MG53二聚体的形式组成。本专利技术还提供一种MG53突变体的多聚体，其特征在于，该MG53突变体的多聚体为MG53的N端的RING结构域7个半胱氨酸中的任一个或两个或两个以上的半胱氨酸突变为非极性氨基酸的突变体；该7个半胱氨酸分别是在RING结构域的第14位点、第17位点、第29位点、第34位点、第37位点、第53位点、第56位点。优选地，这种MG53突变体的突变体的多聚体主要由MG53二聚体的形式组成。在一个实施方案中，在这种突变体的多聚体中，MG53的N端的RING结构域7个半胱氨酸中的任一个或两个或两个以上的半胱氨酸突变成非极性氨基酸，具体为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸。优选地，所述非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸或异亮氨酸。更优选地，在这种MG53突变体的突变体的多聚体中，所述非极性氨基酸为丙氨酸，所述MG53突变体的多聚体选自MG53多聚体C14A、MG53多聚体C17A、MG53多聚体C29A、MG53多聚体C34A、MG53多聚体C37A、MG53多聚体C53A、MG53多聚体C56A中的任意一种。在另一个方面，本专利技术提供一种MG53突变体的多聚体，其中在MG53蛋白的Coiled-coil结构域中的丝氨酸突变为除苏氨酸和酪氨酸以外的氨基酸。在一个实施方案中，Coiled-coil结构域中的丝氨酸突变为非极性氨基酸。在一个实施方案中，在这种MG53突变体的多聚体中，Coiled-coil结构域中的丝氨酸突变为非极性氨基酸，所述的非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、或蛋氨酸。优选地，非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。最优选地，该非极性氨基酸为丙氨酸。在一个实施方案中，当MG53突变体的多聚体中非极性氨基酸为丙氨酸时，所述的MG53突变体选自选自MG53多聚体S150A、MG53多聚体S189A、MG53多聚体S211A中的任意一种或多种。在大多数胰岛素靶器官中，人们已经基本认清胰岛素信号网络的大致骨架结构，即IR/IRSs-PI3K-Akt通路；然而，对于影响此信号途径的具体分子机制，人们的研究目前却刚刚起步。MG53能够有效地泛素化胰岛素受体(IR)和胰岛素受体底物1(IRS1)，其中的MG53的RING结构域，特别是氨基酸序列上第十四位的半胱氨酸，对于MG53催化IR和IRS1泛素化是必需的(CN103965342A)。目前用于治疗溃疡，尤其是慢性皮肤溃疡的现有药物的效果都不太理想。尽管在一些文献，例如CN103275980A和CN101511181B中提示包含MG53的组合物有可能用于治疗溃疡。但现有技术中未进行MG53治疗溃疡的试验研究。本专利技术设计和优化了MG53的多个密码子序列和信号肽序列，通过基因合成、亚克隆，转染、表达和纯化产生了一种MG53多聚体(N≥2)，其中MG53主要以二本文档来自技高网...
【技术保护点】
通过真核生物细胞表达的mitsugumin 53(MG53)多聚体。
【技术特征摘要】
1.通过真核生物细胞表达的mitsugumin53(MG53)多聚体。2.权利要求1的MG53多聚体，其主要由MG53二聚体形式组成。3.通过真核生物细胞表达的mitsugumin53(MG53)突变体的多聚体，其特征在于，该MG53突变体的多聚体为MG53的N端的RING结构域7个半胱氨酸中的任一个或两个或两个以上的半胱氨酸突变为非极性氨基酸的突变体；该7个半胱氨酸分别是在RING结构域的第14位点、第17位点、第29位点、第34位点、第37位点、第53位点、第56位点。4.通过真核生物细胞表达的mitsugumin53(MG53)多聚体的突变体，其特征在于MG53的Coiled-coil结构域中的丝氨酸位点突变为除苏氨酸和酪氨酸以外的氨基酸。5.制备权利要求1或2的MG53多聚体的方法，其包括以下步骤：a.将MG53基因连接到表达载体中获得MG53表达质粒，优选地在所述MG53基因连接到表达载体之前将所述MG53基因与信号肽连接；b.在真核细胞中表达在所述步骤a中连接获得的MG53表达质粒以产生MG53多聚体蛋白。6.制备权利要求3或4的MG53突变体的多聚体的...
【专利技术属性】
技术研发人员：王惠琴，
申请(专利权)人：王惠琴，
类型：发明
国别省市：北京,11
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