乳球蛋白活性肽的超声辅助模拟消化方法及功能食品应用技术

本发明专利技术公开了乳球蛋白活性肽的超声辅助模拟消化方法及功能食品应用，属于乳制品精深加工及功能食品制备技术领域。本发明专利技术先采用超声预处理β‑乳球蛋白，其次蛋白酶进行酶解制备β‑乳球蛋白抗炎多肽，再通过模拟胃肠道消化追踪β‑乳球蛋白抗炎多肽的活性，然后Caco‑2细胞模拟小肠上皮细胞吸收后，表征出了经过胃肠道消化后，被Caco‑2细胞模拟小肠内壁吸收的高抗炎活性的β‑乳球蛋白抗炎多肽。本发明专利技术首次鉴定出了2种经过胃肠道消化后，被Caco‑2细胞模拟小肠内壁吸收具有很强的抗炎活性β‑乳球蛋白功能多肽；本发明专利技术首次报道了β‑乳球蛋白水解产物对血管内皮细胞具有良好的抗炎活性。

Ultrasonic assisted digestion of lactobulin active peptides and its application in functional foods

The invention discloses the ultrasonic assisted analog digestion method and the functional food application of the lactoprotein active peptide, which belongs to the field of intensive processing of dairy products and the preparation of functional food. The present invention first used ultrasound pretreatment of beta lactoglobulin, followed by enzyme hydrolysis to prepare beta lactoglobulin anti-inflammatory polypeptide, then digested the activity of beta lactoglobulin anti inflammatory polypeptide through simulated gastrointestinal tract, and then Caco 2 cells simulated intestinal epithelial cells to be absorbed by gastrointestinal tract after digestion, and Caco (2) the anti-inflammatory peptide of beta lactoglobulin absorbed by the cell wall inside the small intestine. The invention first identified 2 kinds of anti inflammatory activity beta lactoglobulin functional peptides that were absorbed by Caco 2 cells to simulate the inner wall of the small intestine after digestion of the gastrointestinal tract. The invention first reported that the hydrolysates of beta lactoglobulin have good anti-inflammatory activity to vascular endothelial cells for the first time.

【技术实现步骤摘要】
乳球蛋白活性肽的超声辅助模拟消化方法及功能食品应用
本专利技术提供了一种乳球蛋白活性肽的超声辅助模拟消化方法及功能食品应用，属于乳制品精深加工及功能食品制备
，可作为功能性用于制备功能性食品或药物等。
技术介绍
慢性炎症参与人体多种疾病的发生发展，是多种疾病的致病基础。衬于心、血管和淋巴管内表面的单层扁平上皮细胞即血管内皮细胞在血管生物学中起着至关重要的作用，如调节血管紧张度、止血、嗜中性粒细胞募集、激素运输和液体过滤等。血管炎症是导致内皮功能失调的关键性因素之一，与多种疾病密切相关，包括动脉粥样硬化、糖尿病、冠状动脉疾病、高血压和高胆固醇血症。目前，临床上针对炎症的治疗药物主要包括甾体类和非甾体类两种。然而这些药物不仅对人体健康产生一定影响，还需要较大的经济投入。鉴于对长时间使用这些药物的副作用的担忧，以食源性功能食品作为抗炎药物的替代品成为了研究热点，前景广阔。β-乳球蛋白(占乳清蛋白的68％)是除α-乳白蛋白之外的牛乳乳清蛋白的两种主要蛋白之一，它所具有的结构和功能性质日益引起人们的重视。β-乳球蛋白的分子量为18277～18363，分子为一条多肽链，由162个氨基酸残基组成，主要以二聚体形式存在，由非共价键连接的两个单体亚基组成。每个单体含有2个二硫键Cys66-Cys160和Cysl06-Cys199，还有一个Cys121为游离巯基。近年来人们对活性肽研究的范围逐渐扩大，陆续发现了一些源于β-乳球蛋白、有着较强生物活性的肽段，这些肽具有较强的抗高血压的活性、ACE抑制活性、抑菌活性、降低血清胆固醇水平和显著的镇静、止痛、安神的作用。MurakamiM等发现一种来自β-乳球蛋白具有较强的ACE抑制活性的四肽(ALPM)。PellegriniA等(2001)通过蛋白酶对β-乳球蛋白的水解产生了4个具有较强抑菌活性的肽段：VAGTWYf(15-20)、AASDISLLDAQSAPLRf(25-40)、IPAVFKf(78-83)、VLVLDTDYKf(92-100)。但是关于β-乳球蛋白多肽对血管内皮细胞的抗炎活性以及其相关的抗炎多肽的制备方法至今无人报道。现阶段关于β-乳球蛋白功能活性肽的制备方法的研究，主要集中在蛋白酶的筛选、酶解工艺的优化和高活性肽的分离、纯化和鉴定等方法。然而上述研究忽略了口服生物活性肽必须经过胃肠道消化，小肠内皮细胞吸收后，以活性肽形式达到目标器官，才能发挥生理活性作用。胃肠道中含有大量的胃蛋白酶，胰酶，对生物活性肽在吸收之前进行二次酶解；小肠内皮细胞分泌产生细胞酶对途经多肽进一步的分解；与此同时，小肠内皮细胞对多肽的吸收具有多种途经，如转运蛋白介导、跨细胞被动扩散以及细胞旁路转运。把体内胃肠道消化吸收考虑进生物活性肽的制备方法已成必然。专利“从皱纹盘鲍鲍鱼内脏中分离的抗炎肽及其用途”(201510594885.7)，虽然模拟胃肠道消化方法制备抗炎肽，却忽略了小肠上皮细胞对其选择性吸收的影响。综上所述，目前关于β-乳球蛋白制备功能多肽的方法都忽略了胃肠道的消化吸收，并不能真实的模拟生物活性肽在胃肠道消化以及小肠内皮细胞对多肽的吸收。
技术实现思路
鉴于上述不足之处，本专利技术先采用超声预处理β-乳球蛋白，其次蛋白酶进行酶解制备β-乳球蛋白抗炎多肽，再通过模拟胃肠道消化追踪β-乳球蛋白抗炎多肽的活性，然后Caco-2细胞模拟小肠上皮细胞吸收后，表征出了经过胃肠道消化后，被Caco-2细胞模拟小肠内壁吸收的高抗炎活性的β-乳球蛋白抗炎多肽。本专利技术的目的是首次利用β-乳球蛋白水解产物模拟人体胃肠道消化及Caco-2细胞吸收制备得到两种β-乳球蛋白抗炎多肽。其氨基酸序列为：Phe-Tyr-Gln-AlaLeu-Gln-Tyr本专利技术的另一个目的是提供了利用超声预处理β-乳球蛋白，蛋白酶酶解β-乳球蛋白制备功能多肽，模拟人体胃肠道消化及Caco-2细胞吸收制备得到β-乳球蛋白抗炎多肽的方法，按照下述步骤进行：(1)β-乳球蛋白的提取将乳清粉用蒸馏水充分搅拌溶解配成质量浓度为7％的蛋白溶液，然后加入NaCl使其最终的质量浓度为7％，用HCl调节pH至2，用高速离心机在5000r/min下离心20min，收集上清液；用分子截量为14000Da的透析袋取一定量的上清液，放于30倍体积的蒸馏水中静置20h，收集透析袋中的溶液；得到β-乳球蛋白溶液；(2)超声预处理β-乳球蛋白：将底物浓度为1～4g/L的β-乳球蛋白溶液加入超声袋中，密封，然后将样品超声袋直接置于超声反应釜中，进行超声波处理；(3)β-乳球蛋白酶解液制备：调节上述蛋白溶液pH7.5～8.0，加入蛋白酶，酶与底物的比例为1:20～50(w/w)，均匀混合，酶解温度50～70℃，酶解时间2～4h；酶解结束后调节混合液pH为7.0，并在沸水浴中灭酶10min，离心获得上清液，脱盐、浓缩、冷冻干燥成粉末。(4)模拟胃肠道消化：配置人工胃液。在37℃下，将将步骤(3)制备得到的β-乳球蛋白水解物与胃液以1:20～50混合，在震荡频率为120～180rpm条件下模拟胃消化2～4h。用NaOH调节pH为6.8，以1:100(w/v)加入胰酶至混合液，继续酶解4～6h；沸水浴灭酶10min，离心取上清液，脱盐、浓缩、冷冻干燥成粉末。(5)Caco-2模拟小肠上皮细胞吸收：构建Caco-2细胞转运模型，将步骤(4)制备得到的β-乳球蛋白多肽消化产物配置成20mg/ml，加入到Caco-2细胞的绒毛面AP侧(apical，肠腔侧)，0.5～4h后，收集基底面BL侧(basolateral，肠内壁侧)转运的β-乳球蛋白肽，脱盐、冷冻干燥。(6)采用UPLC-MC鉴定及分析多肽序列：对步骤(5)经过Caco-2细胞吸收的β-乳球蛋白多肽进行鉴定及多肽序列分析，筛选出离子强度强，小于1000的多肽序列；(7)多肽的合成以及活性验证：对步骤(6)筛选出来的多肽进行合成，并验证其抗炎活性，最终验证得到两种β-乳球蛋白抗炎活性多肽，其氨基酸序列为：Phe-Tyr-Gln-AlaLeu-Gln-Tyr。其中步骤(2)所述的超声波处理工艺条件如下：超声处理，超声处理时间10-30min，间歇比10s/3s，温度25℃；超声波处理频率及频率组合为：单频：20kHz、28kHz、40kHz；双频：20/28kHz、20/40kHz、28/40kHz；三频：20/28/40kHz。其中步骤(3)所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶或嗜热蛋白酶；优选嗜热蛋白酶。其中步骤(6)中的β-乳球蛋白抗炎多肽优选Leu-Gln-Tyr。上述β-乳球蛋白活性肽作为保健食品应用，经过公知方法的制造成胶囊或者片剂，作为抗炎的保健食品或者功能食品。本专利技术的优势在于：(1)本专利技术首次鉴定出了2种经过胃肠道消化后，被Caco-2细胞模拟小肠内壁吸收具有很强的抗炎活性β-乳球蛋白功能多肽；(2)本专利技术首次报道了一种新颖的用于分离鉴定出可以经过胃肠道消化、吸收的抗炎肽的方法；(3)本专利技术首次研究了β-乳球蛋白多肽消化产物在Caco-2模拟小肠内壁吸收系统的吸收率；(4)本专利技术首次报道了β-乳球蛋白水解产物对血管内皮细胞具有良好的抗炎活性。附图说明图1为本专利技术的技术路线。具体实本文档来自技高网...

【技术保护点】
β‑乳球蛋白活性多肽，其特征在于其氨基酸序列为：Phe‑Tyr‑Gln‑AlaLeu‑Gln‑Tyr。

【技术特征摘要】
1.β-乳球蛋白活性多肽，其特征在于其氨基酸序列为：Phe-Tyr-Gln-AlaLeu-Gln-Tyr。2.根据权利要求1所述的β-乳球蛋白活性多肽，其特征在于其氨基酸序列为：Leu-Gln-Tyr。3.根据权利要求1或2所述的β-乳球蛋白活性多肽的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：(1)β-乳球蛋白的提取将乳清粉用蒸馏水充分搅拌溶解配成质量浓度为7％的蛋白溶液，然后加入NaCl使其最终的质量浓度为7％，用HCl调节pH至2，用高速离心机在5000r/min下离心20min，收集上清液；用分子截量为14000Da的透析袋取一定量的上清液，放于30倍体积的蒸馏水中静置20h，收集透析袋中的溶液；得到β-乳球蛋白溶液；(2)超声预处理β-乳球蛋白：将底物浓度为1～4g/L的β-乳球蛋白溶液加入超声袋中，密封，然后将样品超声袋直接置于超声反应釜中，进行超声波处理；(3)β-乳球蛋白酶解液制备：调节上述蛋白溶液pH7.5～8.0，加入蛋白酶，酶与底物的比例为1:20～50(w/w)，均匀混合，酶解温度50～70℃，酶解时间2～4h；酶解结束后调节混合液pH为7.0，并在沸水浴中灭酶10min，离心获得上清液，脱盐、浓缩、冷冻干燥成粉末；(4)模拟胃肠道消化：配置人工胃液；在37℃下，将将步骤(3)制备得到的β-乳球蛋白水解物与胃液以1:20～50混合，在震荡频率为120～180rpm条件下模拟胃消化2～4h；用NaOH调节pH为6.8，以1:100(w/v)加入胰酶至混合液，继续酶解4～6h；沸水浴灭酶10min，离心取上清液，脱盐、浓缩、冷冻干燥成粉末；(5)Caco-2模拟小肠上皮细胞吸收：构建Caco-2细胞转运模型，将步骤(4)制备得到的β-乳球蛋白多肽消化产物配置成20mg/ml，加...

【专利技术属性】
技术研发人员：任晓锋，张熙，梁秋芳，侯婷，马海乐，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32