本发明专利技术公开了一种猪初乳中分泌型免疫球蛋白A和分泌片蛋白质的提取及纯化方法。本发明专利技术简化了猪初乳分泌型免疫球蛋白A的纯化步骤，逐级盐析后直接选择凝胶过滤，凝胶过滤的柱子为Superdex 200TM Increase 10/300 GL，经后续western-blot实验及质谱实验证明，该方法可以得到较纯的分泌型免疫球蛋白A，使纯化猪初乳免疫球蛋白A的过程简单化，减少生产成本，提高生产效率。同时，将盐析后的初乳进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，已经确认分子量为80KD左右的蛋白质为分泌片蛋白，利用这种方法，可以得到较多的分泌片蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属天然蛋白质分离纯化
，具体涉及一种猪初乳中分泌型免疫球蛋白A和分泌片蛋白质的提取及纯化方法。
技术介绍
乳是哺乳动物分娩后由乳腺分泌的一种白色或微黄色的不透明液体。它含有幼儿生长发育所需要的全部营养成分，是哺乳动物出生后最适于消化吸收的全价食物。而初乳中的免疫球蛋白A是形成新生后代肠道感染防御系统的主要成分，实现了母源免疫物质向新生后代免疫系统的传递，促进了新生后代自身免疫系统的发育并保护其免受病原的感染。
免疫球蛋白A主要有两种形式，其中血清型为单体免疫球蛋白A，而分泌型为多聚的免疫球蛋白A。初乳分泌型免疫球蛋白A是60年代初Tomasi等首先在外分泌液中发现的一种免疫球蛋白A抗体。其分子质量约390KD，主要由免疫球蛋白A双聚体、J链和一个分泌片（secretorycomponent，SC）组成，分泌片是分泌型免疫球蛋白A特异性受体，借二硫键与分泌型免疫球蛋白A共价结合，“J”链可以有效地聚合分泌型免疫球蛋白A，这种结构有助于分泌型免疫球蛋白A在粘嗅表面及外分泌液和乳汁中保持抗体活性。分泌型免疫球蛋白A的生物学功能发挥是与分泌片蛋白结合，然后经上皮细胞吞噬作用释放入肠腔，既可与相应抗原结合，抑制细菌增殖和中和毒素，保护肠粘膜，又能抵抗蛋白溶解酶作用，从而保护肠粘膜防止被消化。关于初乳的纯化，主要分为如下几个方法：
一、凝胶过滤法
最初纯化分泌型免疫球蛋白A是牛初乳除脂肪和酪蛋白后，需连续经过三次凝胶过滤，即葡聚糖G-200、DEAE-52和葡聚糖G-200，才能获得较纯的分泌型免疫球蛋白A。1988年，BABA等将除脂乳清先经10%乙酸分级分离，再用50%饱和硫酸铵沉淀，然后经3次层析：SephacrylS-300，琼脂糖CL-4B凝胶过滤，DEAE-Sehacel离子交换层析，获得高纯度的分泌型免疫球蛋白A。上述方法都需进行多次的凝胶过滤。
二、亲和色谱法
目前纯化分泌型免疫球蛋白A最新的方法是用有结合分泌型免疫球蛋白A能力的金属亲和层析柱，分泌型免疫球蛋白A先用15％聚乙二醇沉淀，再用22％聚乙二醇沉淀，将两次沉淀合并后除去酪蛋白，连续过ACA-44柱和有结合分泌型免疫球蛋白A能力的金属鳌合柱，可获得纯度很高的sIgA。
三、嗜硫色谱法
嗜硫色谱（thiophilicadsorptionchromatography,TAC）又称亲硫色谱，是一种简便、经济的蛋白质纯化技术，近年来，该技术已被应用于从血清、腹水和杂交瘤细胞培养基中的蛋白的纯化。1990年，T.WilliamHutehens利用该方法同步制备初乳乳清中的分泌型免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M，取得良好的分离效果。相对蛋白A亲和色谱，嗜硫色谱可在近中性的条件下吸附－洗脱抗体，克服了蛋白A亲和色谱常常需要在低pH（通常为pH2～3）环境中吸附，但又易引起抗体结构发生改变的缺点，同时嗜硫色谱作用范围更广，且纯化成本低廉。
四、离子交换法
Macro-prepHighQ填料装柱，磷酸缓冲液平衡，加入样品后，分别用不同浓度的NaCl洗脱，收集到的峰进行鉴定。有关Macro-prepHighQAnionExchangeSupport离子交换柱层析的报道很少。经验证此法提纯分泌型免疫球蛋白A时具有操作简便，能够适应多次反复利用而纯化效果稳定，高浓度进行洗脱时能够对所提纯蛋白有很好的浓缩效应，以及收获蛋白纯度高等优点，其浓度和纯度都能够达到预期目的。
五、超滤法
超滤（ultrafiltration,UF）是集蛋白质浓缩和分离为一身的一种纯化方法。此法简便快速、条件温和、无相变、处理量大、蛋白质变性及失活少，可用于分离精制及浓缩。目前超滤技术己被用于乳的浓缩，国外学者逐渐重视超滤法分离乳清蛋白的研究。1989年，日本学者岛崎敬一已经成功将超滤法应用于分离乳铁蛋白。
六、酶解法
选择胃蛋白酶对粗提物进行酶解，在适合的pH值条件下，37℃不同时间作用，选择最佳的酶解时间。因为胃蛋白酶对免疫球蛋白G能起到酶解作用，而且对分泌型免疫球蛋白A的活性没有影响，是一种非常简便易行的分离方法。
国内关于猪初乳中分泌型免疫球蛋白A及分泌片的提取和纯化存在空白，尤其是在进行初乳免疫球蛋白粗提后，都会进行离子交换层析或者亲和层析，最后再进行凝胶过滤，纯化的方法比较复杂，而本专利技术只进行了凝胶过滤，简化了纯化步骤。此外，我们去除猪乳中的酪蛋白的方法是用0.1M的醋酸钠将初乳的pH值调至4.2，同时在盐析时降低了离心力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于一种猪初乳中分泌型免疫球蛋白A和分泌片蛋白质的提取及纯化方法。
本专利技术所采取的技术方案是：
一种分泌型免疫球蛋白A和分泌片蛋白质的分离纯化方法，包括以下步骤：
1）将初乳样品离心，收集中间较清澈的乳清；
2）将上步所得乳清的pH值调节至4.15～4.25，沉淀杂蛋白，离心取上清；
3）将上步所得上清的pH值调节至6.9～7.1；
4）逐级盐析：将上步所得上清用PBS溶液稀释后，用饱和硫酸铵溶液进行逐级盐析，最后离心收集沉淀；将所得沉淀用PBS溶液重悬，得到用于后续凝胶过滤或电泳的样本；
5）凝胶过滤：将上步所得的样本上样至Superdex200TMIncrease10/300GL柱子中进行凝胶过滤，用PBS溶液进行洗脱，根据色谱仪检测的峰型收集对应的洗脱液，即得分泌型免疫球蛋白A；
若需大量获得分泌片蛋白质，对剩下的洗脱液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，收集80KD处的蛋白即得分泌片蛋白质，或者直接对步骤4）盐析后的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，收集80KD处的蛋白即得分泌片蛋白质。
进一步的，步骤1）中离心的转速为11500~12500rpm，时间为28~32min，重复离心两次。
进一步的，步骤2）中pH调节剂为醋酸钠溶液。
进一步的，步骤2）中所述离心的转速为11500~12500rpm，时间为18~22min。
进一步的，步骤3）中pH调节剂为pH值为7.9~8.1的Tris-HCl溶液。
进一步的，步骤5）中所述上样的流速为0.25~0.5ml/min。
进一步的，步骤5）中所述洗脱时的流速为0.2~0.5ml/min。
进一步的，步骤5）中凝胶过滤使用的所有溶液及样品均需通过孔径为0.22μm以下的滤器过滤。
进一步的，步骤5）在连接凝胶过滤柱子Superdex200TMIncrease10/300GL时，要保证液体和液体相接，避免气泡进入系统，然后用PBS进行平衡，流速为0.7~0.8ml/min，压力阈值不超过3MPa；待PBS洗脱体积为28~32ml时，且紫外光及电导的基线保持水平时，即可以上样。
进一步的，所述分泌型免疫球蛋白A和分泌片蛋白质为猪初乳中分泌型免疫球蛋白A和分泌片蛋白质。
本专利技术的有益效果是：
1）本专利技术将猪初乳经预处理和分级盐析后，直接用凝胶过滤方法对粗提的猪初乳免疫球蛋白A进行分离。
2）本专利技术通过凝胶过滤的方法，可以直接获得非变性的分泌性免疫球蛋白A。粗提后的猪初乳，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，80KD左右的变性蛋白质为分泌片蛋白。
3）本专利技术方法与目前的纯化猪初乳中分泌本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分泌型免疫球蛋白A和分泌片蛋白质的分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：1）将初乳样品离心，收集中间较清澈的乳清；2）将上步所得乳清的pH值调节至4.15～4.25，沉淀杂蛋白，离心取上清；3）将上步所得上清的pH值调节至6.9～7.1；4）逐级盐析：将上步所得上清用PBS溶液稀释后，用饱和硫酸铵溶液进行逐级盐析，最后离心收集沉淀；将所得沉淀用PBS溶液重悬，得到用于后续凝胶过滤或电泳的样本；5）凝胶过滤：将上步所得的样本上样至Superdex 200TM Increase 10/300 GL柱子中进行凝胶过滤，用PBS溶液进行洗脱，根据色谱仪检测的峰型收集对应的洗脱液，即得分泌型免疫球蛋白A；若需大量获得分泌片蛋白质，对剩下的洗脱液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，收集80 KD处的蛋白即得分泌片蛋白质，或者直接对步骤4）盐析后的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，收集80 KD处的蛋白即得分泌片蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种分泌型免疫球蛋白A和分泌片蛋白质的分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将初乳样品离心，收集中间较清澈的乳清；
2）将上步所得乳清的pH值调节至4.15～4.25，沉淀杂蛋白，离心取上清；
3）将上步所得上清的pH值调节至6.9～7.1；
4）逐级盐析：将上步所得上清用PBS溶液稀释后，用饱和硫酸铵溶液进行逐级盐析，最后离心收集沉淀；将所得沉淀用PBS溶液重悬，得到用于后续凝胶过滤或电泳的样本；
5）凝胶过滤：将上步所得的样本上样至Superdex200TMIncrease10/300GL柱子中进行凝胶过滤，用PBS溶液进行洗脱，根据色谱仪检测的峰型收集对应的洗脱液，即得分泌型免疫球蛋白A；
若需大量获得分泌片蛋白质，对剩下的洗脱液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，收集80KD处的蛋白即得分泌片蛋白质，或者直接对步骤4）盐析后的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，收集80KD处的蛋白即得分泌片蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中离心的转速为11500~12500rpm，时间为28~32min，重复离心两次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）中pH调节剂为醋酸钠溶液。
【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳旭，贾爱卿，王贵平，甘振磊，刘琪，周如月，
申请(专利权)人：广东海大畜牧兽医研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。