脂质生产菌的育种方法技术

本发明专利技术提供不通过抗生素且可以有效并高效地进行被孢霉属脂质生产菌的育种的育种方法。该方法以被孢霉属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）脂质生产菌的营养缺陷型菌株例如尿嘧啶缺陷型菌株为宿主，进行转化过程。具体来说，采用与此营养缺陷性互补的基因作为标记基因，将该标记基因导入宿主（基因导入步骤）。然后，以上述宿主营养缺陷性的回复为标记，筛选转化株（筛选步骤）。作为上述脂质生产菌，可以是高山被孢霉（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及，尤其涉及不采用抗生素筛选而是通过转化进行被孢霉属(Mortierella)脂质生产菌的育种的方法。
技术介绍
一直以来，人们不断地开发并实际应用通过微生物的代谢来生产有用化合物的技术(广义的发酵技术)。具体来说，例如，具有通过代谢大量地生产脂质的能力的脂质生产菌。作为代表性脂质生产菌，可列举高山被孢霉(Mortierella alpina)等被孢霉属菌类。已知被孢霉属菌类可以生产以花生四烯酸为代表的多不饱和脂肪酸(PUFA)，且被孢霉属菌类是工业上尤其有用的菌类(例如，参照日本特公平7-34752(公告日1995年4月19日，公开公报日本特开昭63-44891，公开日1988年2月25日))。人们对各种有用生物也包含上述脂质生产菌等的微生物进行育种，即改良(品种改良)有用生物的遗传性状，使其具有人们所希望的更好的性状。尤其在发酵技术中，从提高微生物的化合物生产效率、降低该化合物的制造成本等角度出发，育种是非常重要的。育种方法基本上包括制备含有遗传变异的群体的过程(方便起见，称作群体制备过程)和从该群体中筛选出性状更优良的品种的过程(方便起见，称作筛选过程)。无论是群体制备过程还是筛选过程，都可以根据将要进行育种的有用生物的种类采用各种各样的方法，上述脂质生产菌等的微生物的群体制备过程中，主要利用(1)突变处理法和(2)转化法。(1)突变处理法通过突变处理进行群体制备过程时，用各种各样的方法使微生物发生突变来制备群体，但突变本身会随机产生多种突变。因此，即使通过之后的筛选过程能够获得表现目的遗传特征的品种(株)，与目的遗传特征相关的基因以外的其他基因可能发生预料之外的损伤。例如上述脂质生产菌，虽然生产得到的脂质的种类发生变化，但增殖或孢子形成能力等可能会下降。因此，采用通过突变处理来制备群体的过程，并不一定能够得到生产性能好的菌株。而且该方法如上所述，形成群体的个体会随机产生多种突变。因此，在之后的筛选过程中，为了得到表现目的性状的突变体(株)，当没有适宜的筛选方法时，必须对形成上述群体的全部个体的突变种类进行分析，需要耗费庞大的劳动力。(2)转化法而通过转化进行群体制备过程时，以将要育种的有用生物为宿主，导入必须的DNA片段(转化)来获得目的性状，从而得到转化体的群体。即制备只控制与目的吻合的特定基因的表达的群体。因此，在之后的筛选过程中，只要从得到的转化体中筛选更优良品种(株)即可，不仅筛选变得容易，还可以避免上述其他基因产生预料之外的损伤。因此，可以明显减少在育种上花费的劳力。因此，在育种的群体制备过程中，优选转化法。例如，报道了许多与被孢霉属菌类所属的丝状菌的转化方法相关的技术。具体来说，(a)在下述文献1～3等公开了通过颗粒轰击法转化钩巢曲霉(Aspergillus nidulans)或粗糙链孢霉(Neurospora crassa)等丝状菌的技术。在这些技术中，采用尿嘧啶缺陷型菌株作为转化的宿主株，同时采用与尿嘧啶缺陷性互补的基因作为标记基因，选择转化株。此外，(b)作为上述高山被孢霉(M.alpina)的转化方法，已知有下述文献4中公开的技术。在该技术中，将孢子原生质体化，通过电穿孔法将基因导入细胞内。而且，转化体的筛选以来自大肠菌的潮霉素B抗性基因(hpt)为标记基因。因此可以筛选出能够在含有潮霉素的培养基中生长的转化体。文献1Fungaro M.H.et al.Fems microbial Lett.，25，293-297，1995文献2Herzog R.W.et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.，45，333-337，1996文献3Armaleo，D.et al.Curr.Genet.，17，97-103，1990文献4Mackenzie D.A.et al.Appl.Environ.Microbiol.，66，4655-4661.2000但是存在这样的问题利用了上述转化的技术难以有效且高效地对生产PUFA的脂质生产菌进行育种。具体来说，采用上述(a)通过颗粒轰击法转化丝状菌的技术时，作为转化对象的上述A.nidulans或N.crassa等丝状菌的脂质生产性能低，因此不适用于工业生产PUFA等脂质。而在上述(b)文献4中公开的技术是对公知的可以在工业上利用的脂质生产菌M.alpina进行转化的技术。因此，与上述(a)的技术相比，可认为该技术更适合在工业上应用。然而，以M.alpina为代表的被孢霉属的菌类，并不全是潮霉素敏感性。因此用该技术进行育种时，当作为宿主的被孢霉属菌是潮霉素抗性时，就不能用潮霉素抗性作为标记。大多数PUFA是必须脂肪酸，因参与生物体内复杂的生理功能，近年来作为重要的营养素而受到关注。因此，人们渴求能更加高效地生产PUFA的发酵技术，为此，高效且有效地对可靠性高的脂质生产菌被孢霉属菌类进行育种的技术成为必须。本专利技术鉴于上述课题而完成，其目的在于提供不通过抗生素且可以有效并高效地进行被孢霉属脂质生产菌的育种的育种方法。
技术实现思路
本专利技术人等鉴于上述课题进行了潜心研究，结果发现若能获得作为脂质生产菌的被孢霉属菌类的营养缺陷型菌株，并以与该营养缺陷性互补的基因为标记基因建立可转化的系统，那么不仅可以高效且有效地转化被孢霉属菌类的全部菌株，利用该系统还可以自身克隆，能够更加高效且有效地进行育种，从而完成了本专利技术。本专利技术涉及的是被孢霉属(Mortierella)，其特征为，其包含具有基因导入步骤和筛选步骤的转化过程，所述基因导入步骤以上述脂质生产菌的营养缺陷型菌株为宿主，以与上述营养缺陷性互补的基因为标记基因，将该标记基因导入宿主；所述筛选步骤以上述宿主营养缺陷性的回复为标记，筛选转化株。在上述育种方法中，上述脂质生产菌优选Mortierella alpina、Mortierella hygrophila或Mortierella chlamydospora，上述营养缺陷型菌株优选尿嘧啶缺陷型菌株，上述标记基因优选采用乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因或乳清酸核苷酸焦磷酰酶基因。而且，在上述育种方法中，基因导入步骤可以采用电穿孔法或颗粒轰击法。进而，在上述育种方法中，还可以包含从原种的脂质生产菌中获得营养缺陷型菌株的营养缺陷型菌株获得过程。本专利技术的其他目的、特征及优点，可以通过以下说明而充分理解。而且，通过以下结合附图的说明，可以明白本专利技术的有益效果。具体实施例方式下面说明本专利技术的实施方式之一，但本专利技术并不限于此。在本专利技术中，作为育种中制备含有遗传变异的群体的过程(群体制备过程)，实施以营养缺陷性为标记的转化过程。具体为获得作为脂质生产菌的被孢霉属菌类的营养缺陷型菌株，将其作为宿主，导入与上述营养缺陷性互补的基因(转化)。然后，以上述宿主营养缺陷性的回复为标记，从上述群体中筛选转化株。下面，对作为本专利技术对象的被孢霉属的菌类、本专利技术涉及的育种方法及其利用，分别详细地进行说明(1)被孢霉属的菌类作为本专利技术育种方法的对象的被孢霉属菌类，没有特殊限制，可以是归类于被孢霉属的各种丝状菌。被孢霉属可分为Mortierella和Micromucor两个亚属。Mortierella亚属的菌类均生产花生四烯酸等碳原子数为20的脂肪酸，而本文档来自技高网...

【技术保护点】
脂质生产菌的育种方法，其为被孢霉属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）脂质生产菌的育种方法，其特征为，其包含具有基因导入步骤和筛选步骤的转化过程，所述基因导入步骤，以所述脂质生产菌的营养缺陷型菌株为宿主，以与所述营养缺陷性互补的基因作为标记基因，将该标记基因导入宿主；所述筛选步骤，以所述宿主营养缺陷性的回复为标记，筛选转化株。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：落合美佐，河岛洋，清水昌，
申请(专利权)人：三得利株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]