用于证实遗传身份的方法和测试试剂盒技术

用共显性评分证实确定的种群集合体内的遗传身份、遗传多样性、基因组变异或多态性，特别是等位基因变异，还有生物多样性的方法和试剂盒。所述方法和测试试剂盒应用可动因子（ＭＥ），如转座子或逆转录转座子，而且以使用与固相支持物连接的一组或多组任选成对或平行的寡核苷酸为基础。每个寡核苷酸序列代表可动因子的一个插入位点连接点。本发明专利技术还涉及所述方法和试剂盒通过证实遗传身份、遗传多样性、基因组变异或多态性，特别是通过提供共显性评分，用于系统发育研究、亲子关系鉴定、基因型分析、单倍型分析、谱系分析、法学、人类医学诊断以及植物和动物繁殖的用途。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用共显性评分证实确定的种群集合体内的遗传身份、遗传多样性、基因组变异或多态性，特别是等位基因变异，以及生物多样性的方法和测试试剂盒。该方法和测试试剂盒应用可动因子(ME)，而且以使用与固相支持物连接的一组或多组任选成对或平行的寡核苷酸为基础。每个寡核苷酸序列代表可动因子(ME)的一个插入位点连接点。所述方法和测试试剂盒用于遗传身份确定、系统发育研究、亲子关系鉴定、基因型分析、单倍型分析、谱系分析、法学、人类医学诊断和植物及动物的繁殖。
技术介绍
已知特定种群内特定个体(例如，人、动物、细菌、植物等)的基因组对于主要部分而言是独特的，除非高度近亲交配或克隆或无性繁殖。特定基因组的独特性很大程度是由其中所含的DNA序列确定的。假如个体间基因组独特性的差异可反映DNA序列的差异，那么DNA序列变异可用于把个体彼此区别开来，即基因型分析可区别表型。检测DNA序列变异可使用各种实验室过程进行，每个过程都有它们各自固有的限制和优点；在确定所选方法有效性的这两个极端之间存在着一种平衡。无论使用什么方法，目的都是相同的即为了检测DNA序列变异并使用该信息把个体彼此区别开来。把一个个体与另外一个个体区别开来的DNA序列变异的图谱被称作“DNA指纹”。作为一种技术，DNA指纹具有广泛的应用范围，包括但不限制于，法医鉴定、系统发育研究、亲子关系鉴定、法学、人类医学诊断、谱系分析以及动物和植物繁殖。例如，传统的植物繁殖依赖于“繁殖人员眼睛”的专门技术来鉴定，并遵循特定性状的遗传，这些特定性状是通过杂交和回交从供体植物引入到受体种类中的，直到消除供体不需要的遗传背景。实现此繁殖程序目的所需的回交步骤数通常需要若干年的努力。为了加速繁殖程序，可应用高度选择性的标记辅助选择(MAS)和DNA指纹作图法；这些方法是利用分子生物学技术在实验室中进行的。DNA指纹分析可用的DNA标记有很多。每个标记都有其自身固有的优点和缺点。限制性片段长度多态性(RFLP)(Botstein等，Am.J.Hum.Genet.32314-331，1980；WO 90/13668)是其中一种较为先进的标记系统。RFLE的分辨能力可鉴定杂合及纯合状态。换句话说，RFLP是共显性标记。然而，对于常规标记辅助选择(MAS)和DNA指纹分析而言，存在很多与使用RFLP有关的显著缺点。RFLP分析是强度非常大的工作，包括花费较长时间拟定方案和高能放射性同位素的使用，且研究经费高。此外，每次测定可分析的标记数一般仅为1个或2个。由于RFLP的引入，已经研究出了很多可选择性的标记，包括单核苷酸多态性(SNP；Kwok等，Genomics 31123-126，1996)、随机扩增的多态DNA(RAPD；Williams等，Nucl.Acids Res.186531-6535，1990)、简单序列重复(SSR；Zhao & Kochert，Plant Mol.Biol.21607-614，1993；Zietkiewicz等，Genomics 20176-183，1989)、扩增片段长度多态性(AFLP；Vos等，Nucl.Acids Res.214407-4414，1995)、短串联重复(STRs)或可变数量的串联重复(VNTR)以及微卫星(Tautz，Nucl.Acids.Res.176463-6471，1989；Weber和May，Am.J.Hum.Genet.44388-396，1989)。在应用标记的系统之中，可提及序列-特异性扩增的多态性方法(SSAP；Waugh等，Mol.Gen.Genet.253687-694，1997)，逆转录转座子微卫星扩增的多态性(REMAP)系统和间逆转录转座子间的扩增的多态性(IRAP)系统。与常规的RFLP系统相比，REMAP和IRAP(Kalendar等，Theor.Appl.Genet.98704-711，1999)系统耗费的时间明显更少，应用广泛，且可提供更多的信息，但应注意的是，REMAP和IRAP不是共显性标记，因此通常不能用于区别杂合及纯合基因型。基于逆转录转座子的插入多态性(RBIP)(Flavell等，Plant J16643-650，1998)是一种基于逆转录转座子的标记系统。它与微卫星标记系统最为相似，因为每个引物对分析单一位点，且该引物与侧翼于可变区的序列相对应，该可变区产生等位基因变异性。因此，RBIP不同于SSAP、IRAP、和REMAP，其用每个PCR扩增反应揭示多个但无名的位点，且不像微卫星系统，其不仅检测引物间一组简单序列重复(SSR)中的等位基因变异，而且可检测该位置是否存在逆转录转座子。上面讨论的标记分子和系统在WO 93/06239、WO 00/35418、EP967291、WO 01/27321、US 6,114,116、WO 95/11995和WO 99/67421中公开。上面所列标记、标记系统以及专利或专利申请是非穷举的。尽管可获得或建议的系统有很多，但很明显每个系统都有其自身固有的优点和缺点，对于所有目的而言，还没有哪个系统是理想的。应用PCR和基因组因子的标记系统的其中一个问题在于扩增整个基因组因子的能力有时会失败，导致微小误差加倍，降低分辨率。因此，仍然需要提供可选择性的系统，其对于满足现代繁殖技术的要求足够有效。很显然需要一种可选择性的标记系统，包括方法和测试试剂盒，其应用广泛，可使用便宜且技术简单的检测系统提供标记模式的强有力、可再现的产生。专利技术概述本专利技术涉及一种用于证实确定的种群集合体内的遗传身份、遗传多样性、基因组变异或多态性，特别是等位基因变异，以及生物多样性的方法和试剂盒，它们是以检测种群集合体中的基因型整个范围内是否存在可动因子(ME)及其各自的插入位点连接点为基础的。应用与固相支持物连接的寡核苷酸序列的该方法可用于遗传身份确定、系统发育研究、亲子关系鉴定、基因型分析、单倍型分析、谱系分析、法学、人类医学诊断以及植物和动物繁殖。该方法通过记录是否存在可动因子(ME)而检测某一基因组位置的改变。在种群集合体/基因型集合体内得到所期望分辨水平是使用本专利技术公开的方法和测试试剂盒实现的，其可使用剪切的未标记样品DNA进行杂交。这表示，不需要特别小心保存DNA样品。未标记的样品DNA用于杂交的事实意味着当样品DNA本身被标记时，DNA纯度并不重要。此外，参考样品可很容易地维持，且无需像标记DNA那样特别小心地使用。可更便宜地处理大量样品DNA，这是因为只需剪切(DNA提取后)。用于在检测步骤中检测杂交寡核苷酸的方法和测试试剂盒对于样品DNA本身并不特异，但它们以常规方法为基础，依靠一种或多种方式将杂交形式与未杂交的寡核苷酸形式区别开来。因此，它是标准化和自动化的，与所研究的特定样品或其质量无关。由于使用相对简单，该方法和测试试剂盒可使本专利技术内部应用，例如，由繁殖者使用。本专利技术的方法和测试试剂盒为繁殖者提供了一种直接和可行的方法，他们监测并负责他们自己的内部质量控制。本专利技术方法和测试试剂盒的特殊优点是它们可用于对给定的目标基因，可靠地区别回交子代的杂合及纯合状态，而无需在回交后，通过回顾性常规筛选相应的(自体受精)后代来确定接合状本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于证实确定的种群集合体内的遗传身份、遗传多样性、基因组变异或多态性，等位基因变异和共显性评分的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：（ａ）使代表样品总ＤＮＡ的未标记、单链、任选断裂的样品ＤＮＡ与一组或多组不同的任选成对或平行的寡 核苷酸序列杂交，每个寡核苷酸序列代表至少一个可动因子（ＭＥ）的完全或空整合位点，且每个寡核苷酸序列与固相支持物上确定的可识别位置连接；（ｂ）提供任选的杂交后处理，以便除去没有与固相支持物上连接的任选成对或平行的寡核苷酸序列完全杂交的 样品ＤＮＡ；和（ｃ）提供具有可记录标记的杂交产物，所述标记允许记录杂交模式，并由此评分至少一个可动因子（ＭＥ）的完全或空整合位点的存在或缺乏。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：AH舒尔曼，LG波林，
申请(专利权)人：波里尔植物培育有限公司，
类型：发明
国别省市：FI[芬兰]