用于提高种子中选定的氨基酸含量的方法或构建体技术

本发明专利技术提供了用于提高选定的氨基酸含量的构建体和方法，这是通过富含氨基酸序列的蛋白的定向表达或积累，使所述蛋白积累在植物物种或植物组织或器官中。所述提高了的含量是通过用编码载体蛋白的重组核苷酸序列构建体稳定转化植物获得的，在所述构建体的３′－末端具有多氨基酸延伸部分，并且可操作地连接在组织或器官特异性调控序列上。在植物组织，特别是种子的膜状油体和细胞壁中的提高的氨基酸含量，提供了可用作动物饲料的组分。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体上涉及植物生物技术。具体地讲，本专利技术涉及用于提高植物物种或植物组织或器官，包括细胞壁，细胞膜，油体，特别是种子中选定的氨基酸含量的方法和构建体。所述较高的含量是通过提供编码载体蛋白的重组核苷酸序列构建体获得的，所述载体蛋白在它的3′-末端具有多氨基酸延伸部分。披露了通过所述方法获得的组合物，以及所述氨基酸富集的组合物和用一种或多种所述构建体转化过的植物，植物细胞和细胞系的用途。
技术介绍
人类和牲畜的饮食中需要八种必需氨基酸。主要以单一谷物或豆类物种为基础的食物会导致氨基酸的缺乏，这是因为种子蛋白的营养限制，它对人类和动物的饮食需求具有负面影响。例如，谷物种子中的蛋白缺乏赖氨酸和色氨酸，而豆类种子包括缺少含硫氨基酸，即甲硫氨酸和半胱氨酸的蛋白。将种子蛋白用于牲畜饲料必须使所述食物具有预定的氨基酸组成，以便改善动物的健康，有效生长和肉类和乳的良好质量。因此，改良现有的植物蛋白资源是有利的，特别是，改良必需氨基酸的组成，以便更好地适应选定的动物的要求。业已作出了努力，以便使植物氨基酸的组成满足人类和动物的饮食要求，不过，只取得了有限的成功。不过，营养出色的植物突变体和它们的组织的使用受到了负面多效性作用的损害。这些问题包括较差的种子发芽，缓慢的干燥速度，较低的产量，较高的微生物和昆虫易感性，和不良的研磨特征。遗传工程提供了改变植物和植物组织中的必需或任何氨基酸组成的替代方法。为了提高甲硫氨酸或赖氨酸含量，业已对生物合成途径进行了操作，或高-甲硫氨酸/赖氨酸业已在转基因种子中表达(WO96/38574；WO 96/01905；WO 95/31554；WO 95/15392；WO 93/19190；EP 485 970，WO99/40209)。原则上讲，业已采用了三种方法1)改变内源蛋白的氨基酸序列；2)将来自其他植物物种的天然存在的蛋白用于异源表达；和3)表达含有高水平甲硫氨酸/赖氨酸的合成基因。使用来自其他植物的高-甲硫氨酸/赖氨酸蛋白的方法业已披露在US 5,633,436，US 5,580,782和WO94/16078中。为了提高重要豆科粮食作物的营养价值，将决定富硫的向日葵种子白蛋白的种子特异性表达的嵌合基因稳定地转入狭叶羽扇豆(Lupinus angustifoliusL.)中。在包括转入DNA的单一串联插入片段的品系中，向日葵种子白蛋白占可提取种子蛋白的5％。与非转基因的亲本系相比，所述转基因种子包括更少的硫酸盐和更多的总的氨基酸硫；与它相关的是甲硫氨酸含量提高了94％，而半胱氨酸含量降低了12％。种子的其他氨基酸或总氮或总硫含量不存在统计学上的显著改变。第一和第二种方法(上述)的组合业已披露于US 5,850,016中。为了提高马铃薯块茎的甲硫氨酸含量，对编码巴西坚果2S白蛋白的cDNA克隆进行诱变，以便通过2-7个额外的甲硫氨酸残基提高它的甲硫氨酸含量，并且转入马铃薯植物。无论是否突变，叶片中的蛋白含量是低的，占总蛋白含量＜0.01％-0.2％。合成蛋白的使用业已披露于FR 2,744,134，US 5,559,223和WO 92/14822中。为了提高种子中赖氨酸和甲硫氨酸含量，根据α-螺旋-螺旋结构设计了含有31％赖氨酸和20％甲硫氨酸的合成蛋白(CP3-5)。通过菜豆蛋白或β-conglycinin启动子驱动，适当含量的合成蛋白积累在从转基因烟草植物中收获的种子中。在WO 99/15004中，披露了用于改变植物储存器官中的组成的嵌合构建体。编码富硫蛋白的基因具有C-末端KDEL延伸部分，它能够使所述构建体定向进入内质网和高尔基体。上述方法具有某些缺陷，当对于宿主植物来说没有功能性作用的大量外源蛋白表达时，可能导致很多与种子的生理学异常相关的继发性问题，正如在通过传统育种方法产生的等同类型的突变体中所观察到的。本专利技术的首要目的是提供一种方法，包括重组核苷酸序列构建体，使得能够选择用于有效转化任何具有定向表达的需要的植物物种的构建体，所述定向表达使得能够积累富集了一种或多种选定的氨基酸的稳定蛋白，使所述蛋白存在于任何选定的植物组织中。在使用所述构建体时，可以避免表达大量的对宿主植物来说没有功能性作用的外源蛋白的有害作用。本专利技术的第二个目的是提供包括与相容性配方辅助添加剂组合的稳定的氨基酸富集的蛋白的组合物，所述蛋白业已积累在选定的植物组织中。提出所述组合物适合作为来自选定的植物的用于人类的直接的食物来源以及饲料，特别是动物饲料，和作为食品补充物。专利技术概述本专利技术涉及通过一种方法改善植物蛋白的质量，它通过富含形成所述植物蛋白的氨基酸序列的蛋白的定向表达或积累提高了一种或多种选定的氨基酸含量。该方法包括用至少一种重组核苷酸序列构建体转化植物的步骤。所述构建体包括组织或器官特异性调控序列，它能在形态发生的选定的阶段驱动转录。所述调控序列可操作地连接在嵌合核苷酸序列上。用于转化植物，特别是作物的所述嵌合核苷酸序列包括两个关键因子-编码与天然载体蛋白相比具有完整的功能特性的载体蛋白的核苷酸序列，和包括编码具有四-八十个氨基酸残基，并且包括构成所述功能上完整的载体蛋白的一种或多种选定的氨基酸的组合的氨基酸序列的密码子的核苷酸序列。编码载体蛋白的核苷酸序列选自编码植物特异性蛋白的核苷酸序列，所述植物特异性蛋白使得所述氨基酸富集的蛋白能够在植物的选定的组织或器官中定向表达或积累。编码载体蛋白的核苷酸序列缺少终止密码子，并且在它的3′-末端与编码一种或多种氨基酸残基的选定的组合的选定数量的密码子的核苷酸序列框内融合。所述构建体使得氨基酸富集的具有多氨基酸延伸部分的载体蛋白能够在选定的植物组织或器官中进行稳定的定向表达或积累。上述所谓的转化构建体，是通过选择使得能够进行多氨基酸延伸部分的稳定的蛋白翻译和稳定的定向表达或积累的构建体获得的。所述选择是通过体外翻译系统(IVT)和/或瞬时表达系统完成的，并且随后用其他可应用的方法验证。所述IVT系统主要被用于确定最佳数量的密码子，它能够在框内与编码载体蛋白的核苷酸序列框内融合的，而不破坏氨基酸富集的必需的载体蛋白的翻译效力。所述瞬时表达系统包括与编码报道蛋白的核苷酸序列框内融合的上述构建体。将该瞬时表达构建体导入植物细胞，优选采用微粒子轰击方法。然后，选择提供所述报道基因在所述植物细胞中稳定的定向表达的构建体，并且去除来自所选构建体的编码所述报道蛋白的核苷酸序列。将所述构建体用于生产目的，通过用缺少上述报道基因的构建体转化植物，优选使用农杆菌属介导的转化系统。所述方法能够生产氨基酸富集的蛋白，即具有多氨基酸延伸部分的载体蛋白，包括四-八十个氨基酸残基的选定的组合。所述氨基酸有利地是组氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸，赖氨酸，色氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，丝氨酸，苏氨酸，精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺或它们的任意组合。使得能够在植物组织或器官中进行稳定的定向表达或积累的载体蛋白可以从在植物的细胞内交通途径起作用的蛋白中选择。所述载体蛋白优选是细胞壁蛋白或植物病毒蛋白。例如，有用的载体蛋白是油质蛋白，caleosin，steroleosin，cruciferin，napin或植物病毒运动蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高在植物的选定的组织或器官中的一种或多种选定的氨基酸含量的方法，包括用至少一种重组核苷酸序列构建体转化植物，所述构建体包括在形态发生的选定的阶段驱动转录的组织或器官特异性调控序列，所述构建体可操作地连接在嵌合核苷酸序列上，该嵌合核苷酸序列包括：（ｉ）编码载体蛋白的核苷酸序列，所述载体蛋白包括植物特异性蛋白，该蛋白使得氨基酸富集的蛋白能够在植物的选定的组织或器官中定向表达；所述核苷酸序列缺少终止密码子，并且是与以下部分框内融合的（ｉｉ）包括选定的最佳数量的密码子的至少一个核苷酸序列，它所编码的氨基酸序列包括一个或多个氨基酸残基的选定的组合，其中，所述最佳数量的密码子是通过确定允许稳定翻译的数量确定的；所述重组核苷酸序列构建体使得选定的氨基酸富集的具有稳定的多氨基酸延伸部分的载体蛋白在植物的选定的组织或器官中能够进行稳定的定向表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：T瓦尔罗斯，J阿塔贝科夫，Y多罗克霍夫，P苏西，M梅克莱，T科尔佩拉，
申请(专利权)人：波里尔植物培育有限公司，
类型：发明
国别省市：FI[]