本发明专利技术提供了一种在线还原氨基酸二硫化物并测定氨基酸的装置及测定方法。该装置主要由高压泵、高效液相色谱分离柱、在线还原柱、化学发光检测器组成；其基本技术路线是：待测氨基酸溶液通过高效液相色谱柱分离后，进入在线还原柱，溶液中的氨基酸二流化物被在线还原柱中的锌(II)的三(2-羧乙基)膦络合物晶体还原成相应的巯基氨基酸，然后进入化学发光检测器进行氨基酸的在线测定。该在线还原装置检测方法简便，还原过程快速、还原效率高，重复性好，避免了新还原的巯基氨基酸在样品处理和分析过程中被重新氧化为氨基酸二硫化物，具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及到一种快速在线还原氨基酸二硫化物并测定氨基酸的装置及方法，该装置及方法适用于在线快速测定尿液或血浆样品中巯基氨基酸及氨基酸二硫化物的含量。
技术介绍
生物流体中巯基氨基酸和氨基酸二硫化物的含量与人体的健康息息相关。通过对巯基氨基酸和氨基酸二硫化物含量的测定，可以实时监控人体的健康。目前所用的方法是通过离线将其中的氨基酸二硫化物还原成相应的巯基氨基酸，然后再测定各种巯基氨基酸的含量，从而确定样品中各种氨基酸的含量。文献Muha_ad1. K. , Zafar1. Simultaneousdetermination ofascorbic acid, aminothiols，and methionine in biologicalmatrices using ion-pairing RP-HPLCcoupIed with electrochemical detector. J. Chromatogr.，B, 2009, 877:2567 - 2575.介绍了该方法。这种离线操作不仅浪费时间，而且巯基氨基酸在样品处理和接下来的分析过程中容易被自动氧化成氨基酸二硫化物。文献JamesL，James D.The determination of disulphide species withinphysiological fluids.Trends Anal. Chem. , 2012, 21:807-815.报道了采用电化学或者质谱方法直接同时在线测定巯基氨基酸和氨基酸二硫化物，该测定方法程序上比较简单，但是电化学方法电极稳定性差，容易受干扰物质影响，导致灵敏度降低；质谱方法设备复杂，而且昂贵。目前多数测定巯基氨基酸和氨基酸二硫化物还是采用间接方法，这些方法操作步骤多，比较浪费时间。因此，需要设计一种能够快速简单在线还原并同时测定氨基酸二硫化物及巯基氨基酸的方法，通过将分离系统、在线还原系统和测定系统连接起来，达到同时测定巯基氨基酸和氨基酸二硫化物的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中的不足，提供一种快速的在线还原氨基酸二硫化物并测定氨基酸的装置及方法，本专利技术所提供的在线还原氨基酸二硫化物并测定氨基酸的装置如图1所示，其中主要由高压泵、高效液相色谱分离柱、在线还原柱、化学发光检测器组成；其中高压泵(Ia)经过六通进样阀(2)依次与高效液相色谱分离柱(3)和在线还原柱(4)连接，再与化学发光检测器连接(5)。在线还原柱(4)与化学发光检测器(5)之间依次有泵(lb)、泵(lc)、泵(Id)通过T型连接管接入。所述的在线还原柱(4)的结构如图2，是由树脂管(I)、玻璃纤维(2)、TCEP络合物晶体(3 )和石英管(4 )构成的，其中TCEP络合物晶体(3 )填充在石英管(4 )中，两端都填有玻璃纤维(2)，石英管(4)的两端分别用树脂管(I)与其他仪器连接。所述的石英管长度为4_12cm，内径为1_3_ ;石英管在使用前要用纯水冲洗干净，于100°C烘箱中干燥2-3小时；还原柱在使用前要用纯水冲洗3个小时。所述的TCEP络合物晶体是锌(II)的三(2-羧乙基)膦络合物晶体。利用该装置进行在线还原氨基酸二硫化物并测定氨基酸的测定方法是同时启动4个高压泵(la)、( lb)、( lc)、( Id)分别将三氟乙酸溶液、三角形金纳米溶液、鲁米诺溶液、过氧化氢溶液同时注入系统；其中三氟乙酸溶液流过六通进样阀(2)时，将通过注射器(6)注入到六通进样阀(2)中的待测样品载入高效液相色谱分离柱(3)，样品中的各种氨基酸被分离后进入在线还原柱(4)，溶液中的氨基酸二硫化物被TCEP络合物还原成相应的巯基氨基酸，再依次与三角形金纳米溶液、鲁米诺溶液、过氧化氢溶液在线混合，最后进入化学发光检测器(5)进行在线测定。所述的待测样品是人体血浆或尿液，其中所含的氨基酸是巯基氨基酸和氨基酸二硫化物的混合物，其中巯基氨基酸是半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽和谷氨酰半胱氨酸的混合物；氨基酸二硫化物是胱氨酸和高胱氨酸的混合物。所述的三角形金纳米溶液是按照文献Q. Q. Li et al. Aminothiols Sensing BasedonFluorosurfactant-Mediated Triangular Gold Nanoparticle-Catalyzed LuminolChemiluminescence. J. Phys. Chem. C, 2011, 115:10964-10970.报道的方法合成的，三角形金纳米溶液浓度为0. 2-1. 06nmol/L。所述的三氟乙酸溶液中三氟乙酸体积百分数为0. 05-0. 25%，、鲁米诺溶液摩尔浓度为0. 002-0. 02mmol/L、过氧化氢溶液摩尔浓度为0. 2_10mmol/L。所述的三氟乙酸溶液、三角形金纳米溶液、鲁米诺溶液、过氧化氢溶液流速为0. 2-2mL/min。在线还原柱中的还原过程是 +RSSR+H20 — +2RSH其中RSSR是胱氨酸或高胱氨酸，RSH是半胱氨酸或高半胱氨酸。氨基酸二硫化物溶液流过在线还原柱后，被还原成巯基氨基酸。只有巯基氨基酸才能被化学发光检测器测定到。所述的TCEP 络合物晶体是按照文献 Artur K. et al. Coordination PropertiesofTris(2-carboxyethyl)phosphine, a Newly Introduced Thiol Reductant, and ItsOxide.1norg. Chem.，2003，42:1994-2003.报道的方法合成的。当在线还原柱长时间不使用时，放在4°C的冰箱中保存。本专利技术提供的将生物流体中的氨基酸二硫化物还原为相应巯基氨基酸的在线还原柱装置，具有制作过程简单，还原过程快速、简便，还原效率高，重复性好，避免了新还原的巯基氨基酸在样品处理和分析过程中被重新氧化为氨基酸二硫化物等优点，具有较高的实际应用前景。附图说明图1为在线还原柱与高效液相色谱联用的结构示意图。图中1-高压泵、2-六通进样阀、3-色谱柱、4-在线还原柱，5-化学发光检测器，6-注射器。图2为在线还原柱的结构示意图。图中1_树脂管、2-玻璃纤维、3-TCEP络合物晶体、4-石英管。图3为本专利技术的在线还原测定的色谱图与非在线还原的色谱图对比，A是非在线还原的色谱图，B是在线还原的色谱图；出峰顺序为1、胱氨酸，2、半胱氨酸，3、半胱氨酰甘氨酸，4、高半胱氨酸，5、高胱氨酸，6、谷胱甘肽，7、谷氨酰半胱氨酸。具体实施例方式本专利技术所提供的在线还原氨基酸二硫化物并测定氨基酸的装置如图1所示，所用的高压泵的型号为LC-15C，六通进样阀为罗丹妮7725i，高效液相色谱分离柱为C-18柱，化学发光检测器为超微弱化学发光测定仪。所述的在线还原柱(4)的结构如图2，其中石英管长度为10cm，内径为2mm，在使用前要用纯水冲洗干净，于100°c烘箱中干燥3小时；在线还原柱(4)在使用前用纯水冲洗3个小时。 所述的TCEP络合物晶体是锌(II)的三(2-羧乙基)膦络合物晶体，是按照如下步骤合成的将摩尔浓度为3mol/L的高氯酸溶液慢慢滴加到IOOmg氧化锌中，直到本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在线还原氨基酸二硫化物并测定氨基酸的装置，主要由高压泵、高效液相色谱分离柱、在线还原柱、化学发光检测器组成；其中高压泵(1a)经过六通进样阀（2）依次与高效液相色谱分离柱（3）和在线还原柱（4）连接，再与化学发光检测器连接（5）；在线还原柱（4）与化学发光检测器（5）之间依次有高压泵(1b、1c、1d)通过T型连接管接入；所述的在线还原柱（4）的结构是由树脂管（1）、玻璃纤维（2）、TCEP络合物晶体（3）和石英管（4）构成的，其中TCEP络合物晶体（3）填充在石英管（4）中，两端都填有玻璃纤维（2），石英管（4）的两端分别用树脂管（1）与其他仪器连接；所述的石英管长度为4?12cm，内径为1?3mm；所述的TCEP络合物晶体是锌(II)的三(2?羧乙基)膦络合物晶体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吕超，陈清烁，白守礼，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：
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