一种蔬菜鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法技术

一种蔬菜鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，其特征在于：将蔬菜鲜样粉碎混匀，以超纯水作为萃取溶剂，在90℃水浴下浸提20min，离心过滤后，以6‑氨基喹啉‑N‑羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯为衍生剂柱前衍生化，使用XBridge C18色谱柱梯度洗脱，用高效液相色谱‑荧光检测器分离检测。该方法样品制备快速简单、成本低、测定快，精密度、准确度、稳定性以及线性关系良好，整个分析过程快速、灵敏且重现性好，适用于蔬菜鲜样中游离氨基酸的快速分析，易于推广应用，为蔬菜品质鉴定及其开发利用提供了理想的分析方法。

【技术实现步骤摘要】
一种蔬菜鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法
本专利技术涉及分析化学领域，具体涉及一种蔬菜中游离氨基酸含量的快速分析方法，该快速分析方法能够同时分离、分析蔬菜鲜样中17种游离氨基酸。
技术介绍
蔬菜在人们的日常膳食结构中占有重要地位，它们可为人体提供丰富的维生素、胡萝卜素、矿质元素及膳食纤维等营养成分，深受消费者的喜爱。氨基酸是蔬菜中的重要营养成分，各种氨基酸含量及组成直接影响其营养价值，并与人类味觉密切相关。而且对于蔬菜而言，不同种类的氨基酸是其生长发育中必不可少的成分，在蔬菜的氮同化、蛋白质的合成、抵御病虫害等方面具有重要的作用。因此，分析研究蔬菜中游离氨基酸种类和含量对蔬菜品质鉴定具有十分重要的意义，可为今后蔬菜的进一步研究及其开发利用提供依据。目前，对蔬菜中游离氨基酸分析方法的研究中大多先将蔬菜样品烘干、除去水分至恒重后、加酸进行消解再用于氨基酸含量的测定。由于干样通常经烘干、粉碎而成，高温过程中蛋白质变性，其蛋白酶的生物活性丧失，易造成蛋白质降解导致游离氨基酸含量增加，同时烘干等步骤可能会引起蔬菜各种生化成分的转化，使得测定的数据并不能反应样品中氨基酸的真实水平，从而产生检测误差。而且蔬菜样品加酸进行水解，可能造成某些氨基酸如色氨酸被破坏而无法检测。蔬菜干样中氨基酸的分析方法有很多，主要有茚三酮比色法、气相色谱及其质谱联用法、毛细管电泳法、高效液相色谱法等。经典的氨基酸分析方法一般采用氨基酸分析仪，使用茚三酮作为衍生试剂柱后衍生测定。但氨基酸分析仪价格昂贵，分析时间长，专属性强，只能用于分析氨基酸，限制了其广泛应用。相对于其他几种方法，柱前衍生-高效液相色谱法无需特殊反应装置，具有仪器普及率高、分析时间短、方法灵活多样、灵敏度高、易于推广的优点，近年来逐渐成为氨基酸检测的常规手段。
技术实现思路
本专利技术提供一种蔬菜鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，其目的在于解决现有的蔬菜中氨基酸分析方法中存在的速度慢、效率低、精确度不够以及基础应用推广难的问题。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种蔬菜鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，其特征在于：所述快速分析方法包括以下两部分：第一部分，配制溶液，再用高效液相色谱-荧光检测法建立已知梯度浓度的被测的游离氨基酸的标准曲线；所述标准曲线的建立由以下步骤组成：步骤（1），准备氨基酸标准品，分别为天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸；步骤（2），分别配制0.14mol/L的磷酸盐缓冲液、0.4mol/L的硼酸盐缓冲液、0.8mg/mL的AQC衍生液、6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液，6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的浓度为：天冬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；丝氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；谷氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；组氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；甘氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；精氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；苏氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；脯氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；胱氨酸2.5μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、125μmol/L；酪氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；缬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；蛋氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；赖氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；异亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；苯丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；步骤（3），对所述氨基酸混合标准工作溶液进行衍生化反应；移取6种浓度的所述氨基酸混合标准工作溶液，每种浓度的氨基酸混合标准工作溶液均取10μL，置于自动进样瓶中，分别加入70μL所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；分别取20μL所述AQC衍生液，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合，静置后在50~55℃下加热8~15min，取出冷却至室温，供分析用；步骤（4），用高效液相色谱-荧光检测法测定衍生化的所述氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，然后以所述氨基酸混合标准工作溶液的摩尔浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制出所述标准曲线；其中，仪器分离条件为：色谱柱：XBridgeC18色谱柱（规格为3.9mm×15cm，4μm）；柱温37℃；流速2.0mL/min；荧光检测：激发波长250nm，发射波长395nm；流动相：A为磷酸盐缓冲液，按l:10的体积比用超纯水稀释；B为100%乙腈；C为100%超纯水；梯度洗脱程序：0min，100%A；0.5min，98%A+2.0B%；0.5-9.0min，96.5%A+3.5%B；9.0-9.5min，95.0%A+5.0%B；9.5-11.5min，91.5%A+8.5%B；11.5-13.0min，83.0%A+17.0%B，保持4min；17.0min，60.0%B+40%C，保持2min；19-23min，100%A；进样量10μL；第二部分，测定蔬菜鲜样中所述第一部分中的17种游离氨基酸含量，包括以下步骤：步骤（1），样品制备；取蔬菜鲜样搅碎并混合均匀，向蔬菜鲜样中加入超纯水，所述蔬菜鲜样与所述超纯水的投入比为向每1g茶叶鲜样中投入20mL超纯水，在98~102℃条件下浸提28~32min，冷却至室温后，4500~5500r/min离心2~4min，上清液加水定容10mL，过0.45μm微孔滤膜后得到蔬菜样品溶液；步骤（2），对所述蔬菜样品溶液进行衍生化反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蔬菜鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，其特征在于：所述快速分析方法包括以下两部分：第一部分，配制溶液，再用高效液相色谱‑荧光检测法建立已知梯度浓度的被测的游离氨基酸的标准曲线；所述标准曲线的建立由以下步骤组成：步骤（1），准备氨基酸标准品，分别为天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸；步骤（2），分别配制0.14 mol/L的磷酸盐缓冲液、0.4mol/L的硼酸盐缓冲液、0.8mg/mL的AQC衍生液、6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液，6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的浓度为：天冬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；丝氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；谷氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；组氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；甘氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；精氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；苏氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；脯氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；胱氨酸2.5μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、125μmol/L；酪氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；缬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；蛋氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；赖氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；异亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；苯丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；步骤（3），对所述氨基酸混合标准工作溶液进行衍生化反应；移取6种浓度的所述氨基酸混合标准工作溶液，每种浓度的氨基酸混合标准工作溶液均取10μL，置于自动进样瓶中，分别加入70μL所述硼酸盐缓冲液，涡旋混合；分别取20μL所述AQC衍生液，在涡旋状态下加入自动进样瓶中，涡旋混合，静置后在50~55℃下加热8~15min，取出冷却至室温，供分析用；步骤（4），用高效液相色谱‑荧光检测法测定衍生化的所述氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，然后以所述氨基酸混合标准工作溶液的摩尔浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制出所述标准曲线；其中，仪器分离条件为：色谱柱：XBridge C18色谱柱（规格为3.9mm×15cm，4μm）；柱温37℃；流速2.0mL/min；荧光检测：激发波长250nm，发射波长395nm；流动相：A为磷酸盐缓冲液，按l:10的体积比用超纯水稀释；B为100%乙腈；C为100%超纯水；梯度洗脱程序：0min，100%A；0.5min，98%A+2.0B%；0.5‑9.0min，96.5%A+3.5%B；9.0‑9.5min，95.0%A+5.0%B；9.5‑11.5min，91.5%A+ 8.5%B； 11.5‑13.0min，83.0%A+17.0%B，保持4min；17.0min，60.0%B+40%C，保持2min；19‑23min，100%A；进样量10μL；第二部分，测定蔬菜鲜样中所述第一部分中的17种游离氨基酸含量，包括以下步骤：步骤（1），样品制备；取蔬菜鲜样搅碎并混合均匀，向蔬菜鲜样中加入超...

【技术特征摘要】
1.一种蔬菜鲜样中游离氨基酸含量的快速分析方法，其特征在于：所述快速分析方法包括以下两部分：第一部分，配制溶液，再用高效液相色谱-荧光检测法建立已知梯度浓度的被测的游离氨基酸的标准曲线；所述标准曲线的建立由以下步骤组成：步骤（1），准备氨基酸标准品，分别为天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸；步骤（2），分别配制0.14mol/L的磷酸盐缓冲液、0.4mol/L的硼酸盐缓冲液、0.8mg/mL的AQC衍生液、6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液，6种浓度的氨基酸混合标准工作溶液中各氨基酸的浓度为：天冬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；丝氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；谷氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；组氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；甘氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；精氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；苏氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；脯氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；胱氨酸2.5μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、125μmol/L；酪氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；缬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；蛋氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；赖氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；异亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；苯丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；步骤（3），对所述氨基酸混合标准工作溶液进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘腾飞，杨代凤，李军，范君，孙灵湘，钱辉，
申请(专利权)人：苏州市农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32