一种同时测定活性肽及游离氨基酸的方法技术

本发明专利技术属于分析化学领域，涉及营养物质测定方法，公开了同时测定活性肽和游离氨基酸的方法，通过对氨基酸分析测定仪标准测定程序中的缓冲液组成、洗脱程序、洗脱温度的调整，使得多种氨基酸峰与活性肽峰分离，实现了采用氨基酸自动分析仪对游离氨基酸和活性肽的一步法测定，建立了同时制备氨基酸及肽类的方法，克服了传统氨基酸分析仪方法不能够很好的将活性肽和多种游离氨基酸分开、且测试耗时长的缺点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分析检测领域，具体为一种营养及风味物质成分测定方法，尤其涉及一种同时测定活性肽及游离氨基酸含量的方法。
技术介绍
游离氨基酸是水产食品新鲜度和风味的重要评价指标，也是非蛋白氮的重要组成部分；不同的游离氨基酸具有不同的口味，呈现鲜、甜、酸、苦等多种口味，会直接体现出水产品食物的味道以及鲜美程度。如苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸具有甜味，而天冬氨酸、谷氨酸则起着重要的鲜味作用。因此游离氨基酸的含量会被用作许多水产品品质评价的重要鲜度的潜在指标。活性肽是指对生物体的生命活动具有生理活性的肽类化合物，一般是指由2个到20个氨基酸残基组成的特定的蛋白质片段，因为构造的不同也具有不同的生理功能。活性肽除营养功能之外还具有多种生物功能和生理效应，例如：抗氧化、抗菌、降血压、自由基清除剂等等。贝类是一种重要的水产品种，不同生存环境下的贝类体内活性肽和游离氨基酸的组成以及含量也不尽相同。游离氨基酸的含量是评价水产品品质的重要潜在指标，活性肽具有抗氧化、抗菌、降血压、自由基清除等营养功能，因此活性肽的含量也成为表征贝类等水产品品质的重要参数。活性肽多为2至10个氨基酸组成的氨基酸分子链，与游离氨基酸分子结构相似，化学性质接近。在营养物质提取液中不容易将二者分离，再分别测定其浓度。因此，现有技术中多采用一步法同时测定贝类中游离氨基酸和活性肽的含量。目前国内外相关测定活性肽和游离氨基酸的方法有很多，主要有高效液相色谱法和比色法、分光光度法、高效毛细管电泳法。虽然高效液相色谱法、比色法、分光光度法、高效毛细管电泳法可以对活性肽或者游离氨基酸进行测定，但这些方法存在操作复杂、仪器设备成本较高、容易受到杂质干扰、测定结果不准确以及测试种类有限等缺点，未能得到充分推广。目前测定游离氨基酸最主要的方法是氨基酸自动分析仪法，现有技术中也有人采用氨基酸自动分析仪测定谷胱甘肽和游离氨基酸，然而氨基酸分析仪相应的标准方法不能够很好的将活性肽和游离氨基酸分开，并且测试时间长。目前还没有一种方法，能够利用氨基酸自动分析仪有效、快速同时测定活性肽及多种游离氨基酸含量。因此，开发一种利用氨基酸自动分析仪同时测定多种游离氨基酸、谷胱甘肽和肌肽含量的方法，是解决现有技术中问题的关键。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种同时测定活性肽及游离氨基酸的方法，以解决现有技术中不能利用氨基酸分析仪准确、快速同时测定活性肽和游离氨基酸含量的问题。本专利技术的技术方案为，采用优化后的洗脱程序分离样品中的游离氨基酸和活性肽，绘制标准曲线，然后采用标准曲线法测定待测样品溶液中游离氨基酸和活性肽浓度。一种同时测定活性肽及游离氨基酸的方法，其步骤包括，将待测样品溶液加入到氨基酸分析仪中，用缓冲液B1～B5按以下程序进行梯度洗脱，采用茚三酮显色液进行显色：第一阶段：用缓冲液B1洗脱，持续时间20～21min；初始柱温37.5～39℃，第2.0～2.1min时降至34.5～35.5℃，第一阶段结束时将柱温升至55.5～56.5℃；第二阶段：用缓冲液B1和B2洗脱，持续时间11.5～12.5min；先将柱温升至57.5～58.5℃，瞬时调整为B178％～82％、B218％～22％；再匀速变化为B168％～72％、B228％～32％，第二阶段结束时柱温降至55.5～56.5℃；第三阶段：瞬时调整为缓冲液B18％～12％、缓冲液B288％～92％，按这一比例洗脱9～10min，并在第2.8～3.1min时柱温降至41.5～42.5℃；第四阶段：用缓冲液B2洗脱5～6min，并在第四阶段结束时将柱温升至71.5～72.5℃；第五阶段：用缓冲液B3和B4洗脱，16.5～17.5min内从缓冲液B368％～72％、缓冲液B428％～32％匀速调整为缓冲液B358％～62％、缓冲液B438％～42％；柱温为71.5～72.5℃；第六阶段：用缓冲液B3和B4洗脱，2～3min内匀速调整为B354％～56％、B444％～46％，柱温为71.5～72.5℃；第七阶段：用缓冲液B4洗脱17～18min，柱温为71.5～72.5℃；第八阶段：用缓冲液B5洗脱4～5min。在第八阶段结束后柱温降至69.5～71℃。上述比例均为体积比。然后根据同样洗脱条件下活性肽和游离氨基酸的标准工作曲线或回归方程计算待测样品溶液中游离氨基酸和活性肽浓度。优选的洗脱程序为：第一阶段为第0～20.8min，用缓冲液B1洗脱，初始柱温37.5～39℃，第2.1min时调整为34.5～35.5℃，第一阶段结束时将柱温升至55.5～56.5℃；第二阶段为第20.8～32.8min，用缓冲液B1和B2洗脱，将柱温升至57.5～58.5℃，缓冲液B1和B2的比例从B178％～82％、B218％～22％，匀速调整B168％～72％、B228％～32％；第二阶段结束时柱温调整为55.5～56.5℃；第三阶段为第32.8～42.5min，瞬时调整为缓冲液B18％～12％，缓冲液B278％～82％，并按这一比例洗脱；第35.8min时柱温调整为41.5～42.5℃；第四阶段为第42.5～48.0min，用缓冲液B2洗脱，第四阶段结束时柱温调整为71.5～72.5℃；第五阶段为第48.0～65.0min，从缓冲液B368％～72％、缓冲液B428％～32％，匀速调整为缓冲液B354％～56％、缓冲液B444％～46％；第六阶段为第65.0～67.5min，匀速调整为缓冲液B3为54％～56％，缓冲液B4为44％～46％，柱温为69.5～71℃；第七阶段为第67.5～84.5min，用缓冲液B4进行洗脱，柱温为71.5～72.5℃；第八阶段为第84.5～89.0min，用缓冲液B5进行洗脱。更优选的洗脱程序为：第一阶段为第0～20.8min，用缓冲液B1洗脱，初始柱温38℃，第2.1min时调整为35℃，第一阶段结束时将柱温升至56℃；第二阶段为第20.8～32.8min，用缓冲液B1和B2洗脱，将柱温升至58℃，缓冲液B1为80％、B2为20％，并匀速调整为B1为70％、B2为30％，第二阶段结束时柱温调整为56℃；第三阶段为第32.8～42.5min，调整为缓冲液B1为10％，缓冲液B2为90％，并按这一比例洗脱；第35.8min时柱温调整为42℃；第四阶段为第42.5～48.0min，用缓冲液B2洗脱，第四阶段结束时柱温调整为72℃；第五阶段为第48.0～65.0min，瞬时调整为缓冲液B3为70％，缓冲液B4为30％，并匀速调整为B360％、B440％；第六阶段为第65.0～67.5min，匀速调整为缓冲液B3为55％，缓冲液B4为45％；第七阶段为第67.5～84.5min，用缓冲液B4洗脱；第八阶段为第84.5～89min，用缓冲液B5洗脱。在第八阶段结束后柱温降至70℃。所述的缓冲液B1～B5为柠檬酸-柠檬酸锂缓冲体系，pH值分别为2.75～2.85、3.65～3.75、3.55～3.65、4.05～4.15；所述的缓冲液B5为氢氧化锂水溶液。缓冲液B1的pH＝2.75～2.85，柠檬酸三锂浓度为5.5～6g/L，氯化锂浓度为1～1.5g/L，柠檬酸浓度为19～21g/L，乙醇体积含量2.5％～3.5％，辛酸体积含量0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时测定活性肽及游离氨基酸的方法，其特征在于，步骤包括：将待测样品溶液加入到氨基酸分析仪中，用缓冲液B1～B5进行梯度洗脱，洗脱程序包括：第一阶段：用缓冲液B1洗脱，持续时间20～21min；初始柱温37.5～39℃，第2.0～2.1min时降至34.5～35.5℃，第一阶段结束时将柱温升至55.5～56.5℃；第二阶段：用缓冲液B1和B2洗脱，持续时间11.5～12.5min；先将柱温升至57.5～58.5℃，瞬时调整为B1 78％～82％、B2 18％～22％；再匀速变化为B1 68％～72％、B2 28％～32％，第二阶段结束时柱温降至55.5～56.5℃；第三阶段：瞬时调整为缓冲液B1 8％～12％、缓冲液B2 88％～92％，按这一比例洗脱9～10min，并在第2.8～3.1min时柱温降至41.5～42.5℃；第四阶段：用缓冲液B2洗脱5～6min，并在第四阶段结束时将柱温升至71.5～72.5℃；第五阶段：用缓冲液B3和B4洗脱，16.5～17.5min内从缓冲液B3 68％～72％、缓冲液B4 28％～32％匀速调整为缓冲液B3 58％～62％、缓冲液B438％～42％；第六阶段：用缓冲液B3和B4洗脱，2～3min内匀速调整为B3 54％～56％、B4 44％～46％；第七阶段：用缓冲液B4洗脱17～18min；第八阶段：用缓冲液B5洗脱4～8min；上述比例均为体积比；所述的缓冲液B1为pH＝2.75～2.85的柠檬酸‑柠檬酸锂缓冲体系；所述的缓冲液B2为pH＝3.65～3.75的柠檬酸‑柠檬酸锂缓冲体系；所述的缓冲液B3为pH＝3.55～3.65的柠檬酸‑柠檬酸锂缓冲体系；所述的缓冲液B4为pH＝4.05～4.15的柠檬酸‑柠檬酸锂缓冲体系；所述的缓冲液B5为氢氧化锂水溶液。...

【技术特征摘要】
1.一种同时测定活性肽及游离氨基酸的方法，其特征在于，步骤包括：将待测样品溶液加入到氨基酸分析仪中，用缓冲液B1～B5进行梯度洗脱，洗脱程序包括：第一阶段：用缓冲液B1洗脱，持续时间20～21min；初始柱温37.5～39℃，第2.0～2.1min时降至34.5～35.5℃，第一阶段结束时将柱温升至55.5～56.5℃；第二阶段：用缓冲液B1和B2洗脱，持续时间11.5～12.5min；先将柱温升至57.5～58.5℃，瞬时调整为B178％～82％、B218％～22％；再匀速变化为B168％～72％、B228％～32％，第二阶段结束时柱温降至55.5～56.5℃；第三阶段：瞬时调整为缓冲液B18％～12％、缓冲液B288％～92％，按这一比例洗脱9～10min，并在第2.8～3.1min时柱温降至41.5～42.5℃；第四阶段：用缓冲液B2洗脱5～6min，并在第四阶段结束时将柱温升至71.5～72.5℃；第五阶段：用缓冲液B3和B4洗脱，16.5～17.5min内从缓冲液B368％～72％、缓冲液B428％～32％匀速调整为缓冲液B358％～62％、缓冲液B438％～42％；第六阶段：用缓冲液B3和B4洗脱，2～3min内匀速调整为B354％～56％、B444％～46％；第七阶段：用缓冲液B4洗脱17～18min；第八阶段：用缓冲液B5洗脱4～8min；上述比例均为体积比；所述的缓冲液B1为pH＝2.75～2.85的柠檬酸-柠檬酸锂缓冲体系；所述的缓冲液B2为pH＝3.65～3.75的柠檬酸-柠檬酸锂缓冲体系；所述的缓冲液B3为pH＝3.55～3.65的柠檬酸-柠檬酸锂缓冲体系；所述的缓冲液B4为pH＝4.05～4.15的柠檬酸-柠檬酸锂缓冲体系；所述的缓冲液B5为氢氧化锂水溶液。2.根据权利要求1所述的同时测定活性肽及游离氨基酸的方法，其特征在于，所述洗脱程序包括：第一阶段为第0～20.8min，用缓冲液B1洗脱，初始柱温37.5～39℃，第2.1min时调整为34.5～35.5℃，第一阶段结束时将柱温升至55.5～56.5℃；第二阶段为第20.8～32.8min，用缓冲液B1和B2洗脱，将柱温升至57.5～58.5℃，从B178％～82％、B2、18％～22％，匀速调整为B168％～72％、B228％～32％；第二阶段结束时柱温调整为55.5～56.5℃；第三阶段为第32.8～42.5min，瞬时调整为缓冲液B18％～12％，缓冲液B278％～82％，并按这一比例洗脱；第35.8min时柱温降至41.5～42.5℃；第四阶段为第42.5～48.0min，用缓冲液B2洗脱，第四阶段结束时柱温升至71.5～72.5℃；第五阶段为第48.0～65.0min，从缓冲液B368％～72％、缓冲液B428％～32％，匀速调整为缓冲液B354％～56％、缓冲液B444％～46％；第六阶段为第65.0～67.5min，匀速变化为缓冲液B354％～56％，缓冲液B444％～46％；第七阶段为第67.5～84.5min，用缓冲液B4进行洗脱；第八阶段为第84.5～89.0min，用缓冲液B5进行洗脱。3.根据权利要求1所述的同时测定活性肽及游离氨基酸的方法，其特征在于，所述洗脱程序包括：第一阶段为第0～20.8min，用缓冲液B1洗脱，初始柱温38℃，第2.1min时调整为35℃，第一阶段结束时将柱温升至56℃；第二阶段为第20.8～32.8min，用缓冲液B1和B2洗脱，将柱温升至58℃，从缓冲液B180％、B220％匀速调整为B170％、B230％，第二阶段结束时柱温调整为56℃；第三阶段为第32.8～42.5min，调整为缓冲液B1为10％，缓冲液B2为90％，并按这一比例洗脱；第35.8min时柱温调整为42℃；第四阶段为第42.5～48.0min，用缓冲液B2洗脱，第42.0min时柱温调整为72℃；第五阶段为第48.0～65.0min，瞬时调整为缓冲液B370％，缓冲液B430％，并匀速调整为B3为60％、B4为40％；第六阶段为第65.0～67.5min，匀速调整为缓冲液B3为55％，缓冲液B4为45％；第七阶段为第67.5～84.5min用缓冲液B4洗脱；第八阶段为第84.5～89min，用缓冲液B...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱伟强，谢晶，陈舜胜，金银哲，蓝蔚青，桂娟，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海;31