一种溶菌酶蛋白生产工艺及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种人溶菌酶蛋白生产工艺。目前市场上的溶菌酶蛋白都来源于其他种属动物机体，对人体而言是异种蛋白，有很强的抗原性，副作用大。本发明专利技术的生产的溶菌酶蛋白具有人源的天然氨基酸序列，解决了异源性溶菌酶用于人体内的抗原性问题。更重要的是，人体中的溶菌酶活性最高，本发明专利技术提供的蛋白生产工艺与传统工艺相比，分离纯化步骤简单易行，能得到较高的蛋白投入产出比，为人溶菌酶蛋白的工业化生产提供了一个高效的生产工艺。本发明专利技术还涉及上述方法及其产物的应用。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体而言，本专利技术涉及一种用人LYC7核苷酸生产人溶菌酶蛋白的方法。本专利技术还涉及用上述工艺生产人溶菌酶所需的载体、重组质粒、宿主细胞、获得的溶菌酶蛋白产物及该生产方法的应用。
技术介绍
随着生物技术的发展，获得蛋白的方法越来越多，经典的蛋白质分离纯化过程通常包括以下步骤(1)破碎生物组织，用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来；(2)用离心法将细胞的亚细胞颗粒(如细胞核、线粒体、微粒体或核糖体等及细胞碎片去除；(3)应用盐析法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来；(4)进一步应用层析法或电泳使各种蛋白质分开；(5)如果用可能的话，将蛋白质结晶或制成冻干粉。用该方法获得人源蛋白需考虑以下问题第一，人组织来源少，而目的蛋白含量高、活性高可溶性稳定性好的组织来源就更少了；第二，每个分离纯化的步骤都会损失一定量的蛋白及蛋白活性，但是分离步骤太少又不能达到一定的纯度；第三，每个分离纯化的步骤中所用的试剂及相关参数对不同的蛋白的适用范围都是不同的；第四，不同蛋白的精确定性定量通常需要特定的方法。随着生物化学的发展，肽的人工合成已成为可能，然而这种方法只适合于合成最多含有几百个氨基酸残基的小蛋白，况且化学仪器中合成的蛋白是否与天然存在的蛋白具有一致的构象与功能还有待于进一步研究。目前，运用基因工程技术也可以在大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物等多种表达体系中高效表达，但是这种生产蛋白的方法同样涉及到分离纯化的问题。溶菌酶是分解粘多糖的多肽类免疫抗菌分子。它具有耐热、耐酸的理化特性，可溶于水、乙醇、油脂类溶剂，通过裂解细胞壁而达到裂解革兰氏阳性细菌的效果。对溶菌酶杀菌能力研究表明极微量的溶菌酶即可杀灭溶壁微球菌、藤黄球菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、细球菌、八迭球菌、葡萄球菌等自然界常见细菌。目前市场上的溶菌酶都是来源于其他种属动物机体，对人体而言是异体蛋白，有很强的抗原性，副作用大。本专利技术的人溶菌酶技术解决了异源性溶菌酶用于人体内的抗原性问题，更重要的是，人体中的溶菌酶活性最高，本专利技术提供的蛋白生产工艺与传统工艺相比，分离纯化步骤简单易行，能得到较高的蛋白投入产出比，为人溶菌酶蛋白的工业化生产提供了一个高效的生产工艺。本专利技术的另一个目的是提供一种用上述核苷酸序列生产人溶菌酶蛋白的方法。本专利技术的再一个目的是提供一种重组载体，该载体含有人LYC7核酸序列并可以通过转化宿主细胞，如大肠杆菌、酵母细胞，表达出溶菌酶蛋白。本专利技术的再一个目的是提供一种宿主细胞，该含有人LYC7核苷酸序列的重组质粒并可表达具有溶菌酶活性的蛋白。本专利技术还提供了这种生产方法以及用该方法生产出的溶菌酶蛋白的应用。在本专利技术的一个方面，提供了一种用LYC7核苷酸序列生产具有人溶菌酶活性蛋白的方法，该方法包括(1).将分离纯化的编码具有人溶菌酶蛋白活性多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人溶菌酶蛋白表达载体；(2).将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，筛选出表达人溶菌酶蛋白的重组细胞；(3).高密度培养步骤(b)中的重组细胞；(4).分离出具有人溶菌酶活性的蛋白，并将其制成冻干粉。在本专利技术中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”溶菌酶蛋白(或多肽)编码序列是指，该序列或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该序列或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本专利技术中，术语“溶菌酶蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有溶菌酶蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中核苷酸序列同源性低至约92％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中核苷酸序列杂交的核苷酸序列，更佳地能在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.1中核苷酸序列的同源性至少92％的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与人溶菌酶相同功能的蛋白的、SEQ IDNO.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。获得上述溶菌酶蛋白(或多肽)编码序列，可以通过人工化学合成、从现存的DNA库扩增、从含有该序列的细胞、组织、器官中分离纯化得到。在本专利技术中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。在本专利技术中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞等。在本专利技术中，人LYC7的表达载体是如此获得的首先，根据SEQ IDNO 1所述核苷酸序列及表达蛋白所使用的载体pPIC9序列，合成如SEQID NO 3所述核苷酸序列；将合成后的序列与pUCml9 T载体(上海SHANGON生物工程公司)连接形成Lyc7-pUCml9重组质粒。分别用限制性内切酶Xho I和EcoR I酶切Lyc7-pUCml9质粒和pPIC9质粒并分别进行胶回收。随后用T4 DNA连接酶连接经过处理的目的片段和pPIC9质粒。最后将连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α，涂布LB-Amp平板，酶切鉴定转化子，抽提质粒，测序验证序列的正确性。本专利技术中，表达人溶菌酶的甲醇酵母菌株是按如下方法获得的抽提37℃培养18小时的Lyc7-pPIC9质粒，然后，用3-6ul限制性内切酶SacI切割100-200ug抽提的Lyc7-pPIC9质粒3-6小时，完全酶切后用与酶切体积相等的氯仿/异戊醇溶液(两者体积之比为24∶1)纯化酶切产物，之后用100％乙醇沉淀酶切的质粒，用10-30ul去离子水溶解沉淀并通过核酸电泳测定质粒浓度。制备酵母GS115菌株的感受态。取经限制性内切酶SacI切割后回收并定量的Lyc7-pPIC9质粒5～20ug(溶于5-10ul去离子水中)，加入80ul酵母GS115感受态细胞，转至电转化杯，电击转化。转化参数为；电压1500伏，电阻200欧姆，电容25微法。电击后迅速加入800ul的1M山梨糖醇。取电击液200-600ul涂MD(极限无水葡萄糖培养基)板，30℃培养至克隆长出。用50ml酵母培养基BMMY培养长出的克隆，30℃，取培养上清走SDS-PAGE电泳，筛选表达目的蛋白的克隆。本专利技术中“MD培养基”按如下方法配制称15g琼脂粉溶于800ml水中，115℃灭菌20分钟。待溶液凉至60℃，加入下列成份100ml 10×YNB(酵母基本氮)，2ml 500×B(生物素)，100ml 10×D(无水葡萄糖).每20ml倒一块板。各成份的配制如下10×YNB称34g YNB，100g(NH4)2SO4用水配成1升溶液，用0.22微米的膜过滤灭菌。500×B称20mg生物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生具有溶菌酶蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括： （ａ）将编码具有人ＬＹＣ７核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人溶菌酶蛋白表达载体； （ｂ）将步骤（ａ）中的表达载体转入宿主细胞，筛选出表达人溶菌酶蛋白的重组细胞； （ｃ）高密度培养步骤（ｂ）中的重组细胞； （ｄ）分离出具有人溶菌酶活性的蛋白，并将其制成冻干粉。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：余龙，郭泽坤，唐丽莎，蒋道军，张亚州，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]