利用荧光嵌入剂对双链和三链核酸在溶液中杂交的荧光强度分析制造技术

本发明专利技术提供了对核酸杂交的一种均相分析。包含探针、靶以及嵌入剂的杂交介质的荧光强度是该探针对于该靶的杂交效率的函数。本分析可以检测单链探针与非变性的双链靶之间形成三链体的特异性杂交，因此无需变性靶。本分析也可检测双链杂交复合体。本分析可用于识别折叠核酸序列中的可及区域，判定杂交复合体中错配碱基对数，以及为基因组作图。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
专利技术说明专利技术背景1.专利
本专利技术涉及核酸的测序或分析方法，更具体地涉及利用荧光强度检测分析三链和双链核酸杂交复合体的方法。2.相关领域说明几十年来，荧光染料一直被用来检测并量化核酸。基于荧光强度分析的最基本形式通常包含靶核酸与含有荧光团的探针接触，从结合探针中将未结合探针去除，检测洗涤样品中的荧光。均相分析在此基本分析上有了提高，前者并不需要洗涤的步骤，或不需要提供非液相的支持。例如，Livak等的美国专利5,538,848和Maggio的美国专利4,220,450公布了利用溶液中的寡核苷酸探针对核酸序列基于均相荧光的分析。然而，这些专利需要淬灭剂与报告剂组合使用，以区分杂交探针和未杂交探针所产生的信号。Livak等在其公布的方法中还要求使用酶。淬灭剂与酶增加了该方法的复杂性和花费。Kidwell的美国专利5,332,659公布了检测溶液中核酸序列的方法，其使用包含至少两个荧光基团部分的探针。这些荧光基团的选择要求是，当二者间距足以改变其光谱的波长依赖性时，互相之间有电性的干扰。未杂交的探针比杂交到靶序列上的探针更灵活，因此，未杂交探针上的两个荧光基团部分比杂交探针上的更可能相互靠近。因此，可以监测与游离探针相关的发射波长的变化，作为样品中游离探针数量的指示。Wu等的美国专利5,846,729也公布了核酸杂交的基于均相荧光的分析。基于某些荧光团在杂交复合体中结合于核酸链之间的能力，一些分析也利用嵌入荧光团检测核酸杂交。例如，Burke等的美国专利5,824,557公布了检测并量化核酸分子的方法和试剂盒。优选的实施方案取决于将染料嵌入双链核酸的双螺旋或单链核酸中。染料在嵌入之后发出荧光，其强度直接反映了样品中存在的核酸量。尽管Burke等的方法声称可用于检测样品中的核酸量，但是这种方法基于嵌入染料与核酸之间非特异性的结合，使该方法对于检测特异性结合，尤其是存在非靶核酸双链的情况中不实用。Ishiguro等的美国专利5,814,447公布的方法宣称，对依赖于嵌入染料和核酸双链间非特异性结合的方法作了改进，这些方法如Burke等的方法以及由Ishiguro等早期在日本专利公开237000/1993中所描述的方法。早期的发展包括在靶核酸一个特定区域经PCR扩增之前，加入嵌入荧光素，该荧光素嵌入到样品溶液后荧光强度增加，以及以给定时间间隔对反应溶液的荧光强度进行检测，以检测并量化扩增前的靶核酸。该447专利试图通过提供提高了特异性的分析方法对前期的发展进行改进，该分析的特征在于探针是标记了嵌入荧光素的单链寡核苷酸，该荧光素被嵌入到介于靶核酸与单链寡核苷酸探针之间互补的结合部分。除了上述检测荧光强度的研究外，还有一些研究极力推荐荧光极性分析的优点。然而，基于极性的分析有一些明显的缺点。以极性的变化程度作为结合的函数是难以预测的，对于不一致数据进行解释使其符合理论的预期，这在分析方法中是不理想的，特别当这种分析是自动化分析时。尽管有以上的研究成果，本领域仍需要用于核酸之间和/或核酸类似物间相互作用的简便、高灵敏度、有效并且快速的分析方法。所有在此引用的参考文献以其全文在此引作参考。专利技术概述本专利技术提供了一种分析结合的方法，所述方法包含提供包含至少一种核酸序列的靶；提供包含与至少一部分所述靶不完全互补的核酸或核酸类似物序列的探针；提供一种嵌入剂，其中所述探针或所述嵌入剂之一含有荧光团；将所述探针、所述靶和所述嵌入剂加入杂交介质，作为检测样品；用激发辐射照射所述检测样品，使所述荧光团发出荧光；检测所述荧光辐射的强度，其中所述强度是所述探针与所述靶之间结合亲合力的一种直接指征；以及从所述强度中确定所述探针与所述靶之间的错配程度。附图简述本专利技术将与以下附图一同描述，在这些附图中，类似的参考数字命名类似元件并且其中附图说明图1A、1B、2、3A、3B、4、5、6A、6B、7A、7B、8A和8B是各分析样品最大荧光强度以温度为函数所绘制的组合图。优选实施方案的详细说明本专利技术提供了一种分析靶与探针结合的快速、灵敏、环保而且安全的方法，其中该靶包含核酸序列或核酸类似物序列，探针包含核酸序列或核酸类似物序列。与某些先前的分析方法不同，本专利技术不仅检测杂交是否存在，还提供有关探针和靶之间杂交性质的定量和定性信息。因此，本专利技术使操作者可以区分是完全匹配、单碱基对错配、两个碱基对错配、三个碱基对错配、单碱基对缺失、两个碱基对缺失、还是三个碱基对缺失。本专利技术的实施方案包括将第一个探针-靶混合物中检测到的荧光强度，和在其它探针与相同的靶和相同嵌入剂组合发出的荧光强度进行校准，其中其他探针每一个与第一个探针有至少一个碱基的差异。本专利技术方法检测到的荧光强度随探针与靶间结合亲合力的增加而增加。与荧光各向异性方法不同，本方法无需检测荧光的极化。从而可产生标准曲线，其中强度是靶和探针之间结合亲合力的函数。因为靶与多种不同探针间的结合亲合力因错配碱基数不同、错配的性质不同(A-G对A-C对T-G对T-C等)、错配碱基在杂交复合体中的位置等因素，各有差异，因此，本专利技术分析可用于对靶测序。本专利技术可以量化探针与靶之间的结合亲合力。这样的信息在许多方面非常有用，包括设计具有最佳结合特性的反义药物。与先前的方法不同，本专利技术的分析优选是均相的。该分析在检测荧光强度之前，无需将探针-靶复合体与游离探针和靶分离。该分析无需凝胶分离的步骤，因此检测通量有很大提高。定量分析简便准确。此外，该分析优选地在均相溶液中进行，不需要通过过滤和多步润洗，或通过凝胶电泳将结合复合体与未结合探针分离。因此，这种结合分析可节省大量的时间和花费，而且容易自动化完成。进一步，这种分析使结合中的一些变量，如缓冲液、pH、离子浓度、温度、温育时间、探针和靶序列的相对浓度、嵌入剂浓度、靶序列长度、探针序列的长度以及可能的辅助因子的要求被快速确定。此外，本专利技术的分析优选在进行时无需提供对靶和探针的信号淬灭剂。本专利技术的优选实施方案特异地检测探针与双链靶之间的三链体杂交，因此无须将靶序列变性。当PNA探针已知可与某些类型的靶形成三链体时(参见，如Egholm等，365 Nature 566(1993)，和Tomac等，118 J.Am.Chem.Soc.5544(1996))，本专利技术者惊讶地发现，这些PNA探针能够特异地分析单链核酸(如ssDNA和RNA)探针与双链核酸(如dsDNA)靶之间形成的三链体。本专利技术分析中使用的合适的探针包括，如ssDNA，RNA，PNA以及其它具有不带电荷主链的核酸类似物。优选长度为8到20个碱基的探针序列，因为该范围是原核和真核生物已发现的最小的独特DNA序列范围。特别优选12到18个碱基的探针，因为这是人基因组中最小的独特序列的长度。实施方案中，优选6-30个碱基的探针，并最优选15个碱基。不过，多个更短的探针可用于检测具有多个非独特靶序列的核酸序列，这些探针组合用来独特地识别核苷酸序列。本专利技术无须使用危险、操作烦琐、耗时，而且需要经常再生的放射性探针。本专利技术的探针优选的是数年都安全稳定的探针。相应的，探针可大量地制备或订购和储存。本专利技术者还惊讶地发现平行PNA探针比传统合成的反平行PNA探针效果好得多。核酸靶序列比PNA探针长三倍以上时，平行和反平行PNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
分析结合的一种方法，所述方法包含：提供包含至少一种核酸序列的靶；提供包含与至少一部分的所述靶不完全互补的核酸或核酸类似物序列的探针；提供一种嵌入剂，其中所述探针或所述嵌入剂之一含有荧光团；将所述探针、所述靶和所述嵌入剂加入到 杂交介质中，作为检测样品；用激发辐射照射所述检测样品，使所述荧光团发出荧光；检测所述荧光辐射的强度，其中所述强度是所述探针与所述靶之间结合亲合力的一种直接指征；以及从所述强度中确定所述探针与所述靶之间的错配程度。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：亚斯曼I戴克斯，皮埃尔皮卡德，格伦H埃里克森，
申请(专利权)人：英詹尼斯公司，
类型：发明
国别省市：BB[巴巴多斯]