利用PCR确定已知DNA序列的两侧未知序列的方法技术

本发明专利技术是一种利用ＰＣＲ确定已知ＤＮＡ序列的两侧未知序列的方法。它是通过对已知序列的限制性内切酶位点进行酶切，设计合适的ＰＣＲ引物，进行ＰＣＲ扩增，最后对所得片断进行克隆和序列测定。本发明专利技术技术设计简单易行，操作限制少，应用范围广，结果分析简便可靠，而且成本低廉。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物工程
，是一种利用PCR(Polymerase Chain Reaction)反应，从部分已知DNA(Deoxyribonucleic Acid)序列确定该DNA或基因序列两侧的未知DNA序列的方法。本专利技术提出的根据部分DNA序列来确定其两侧未知DNA序列的方法，是通过对已知序列的限制性内切酶位点进行酶切，选择合适的PCR引物，进行PCR扩增。其具体步骤如下(1)寡聚脱氧核糖核酸引物设计根据已知序列设计半巢式PCR引物(semi-nested PCRprimers)，分别命名为P1和P2，长度为15-25bp(base pair)，要求P1、P2引物的5’到3’是从已知DNA序列区域向待测定的未知DNA序列区域方向延伸。P2比P1更靠近待测的未知序列部分，而且两者可以部分的重叠(见附图说明图1所示)。P2的3’端距离待测序列要保留15-100bp，合成引物LP(Link Primer)，3’末端的四个寡聚脱氧核糖核苷酸为GTGC，长度为15-25bp，表述如5’-XXXGTGC-3’，其中的XXX表示根据基因组DNA的GC含量来设计的11-21bp长度的寡聚脱氧核糖核苷酸，其GC含量要与基因组DNA的接近；再设计三种寡聚脱氧核糖核苷酸，分别命名为MBO，TAQ和MAE，序列为MBO(为八碱基)5’-GATCGCAC-3’，TAQ(为六碱基)5’-CGGCAC-3’，MAE(为六碱基)5’-TAGCAC-3’(2)限制性内切酶的选择根据对已知DNA序列上的限制性内切酶(RE，restrictionenzyme)酶切位点的分析，选用在已知序列上没有酶切位点的常用酶，或者选择在从P1到待测的未知序列之间没有酶切位点的酶，对基因组DNA进行酶切，并与三种寡聚脱氧核糖核苷酸作用。本专利技术可选用三种生成同样粘端的同裂酶，分别为生成5’-GATC-3’粘性末端切口的BamH I，Sau3A I，Mbo I，Dpn I；生成5’-CG-3’粘性末端切口的Aci I，Cla I，Hin 6I，MaeII，Msp I，Taq I；生成5’-TA-3’粘性末端切口的Bfa I(MaeI*)，Csp6 I MseI，Nde I，MseI。本专利技术中，上述三种类型的寡聚核苷酸，可以根据不同的GC含量的基因组来选择使用，高GC含量(＞60％)选用TAQ与LP作用，低GC含量(＜40％)选用MAE与LP作用。或者根据实际需要作出调整，或者同时使用三种，可以满足大部分的实验要求。经与寡聚核苷酸作用后，抽提基因组DNA(具体方法根据不同的样品有差异)，将基因组DNA用根据上述原则确定的限制性内切酶作用0.5-18小时后，纯化基因组DNA片断。如可先用酚—氯仿去除限制性内切酶，再用乙醇沉淀的方法纯化获得基因组DNA片段；(3)PCR模板构建按照一定比例将寡聚脱氧核糖核苷酸MBO或TAQ或MAE与LP作用，使LP与相应的碱基配对部分形成双链，再与基因组DNA酶切后的产物在12-25℃用连接酶连接5-24小时。作为PCR模板。流程见图2。本专利技术中，MBO、TAB或MAE与LP的反应条件可以为在50-80℃加热5-30分钟，然后室温退火。(4)PCR扩增以步骤(3)中的产物为模板，以P1和LP为首轮PCR引物，PCR扩增待测的未知DNA序列。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收，再用LP和P2进行PCR扩增。对所得到的片段进行克隆和序列测定。根据P2和未知序列之间保留的15-100bp长度的已知DNA序列，可以快速验证所获得的序列是否为目标序列。本专利技术的优点本专利技术的单侧PCR法如同RACE方法一样可以测定已知DNA序列两端的未知序列。但是RACE所采用的是在RNA基础上的操作。与RACE相比，更具有如下的优点1、技术设计简单易行。本专利技术提供了一种在已知部分DNA序列的基础上测定其两端未知序列的有效，快速的实用方法，2、简化劳动。与传统方法比较，避免了对基因组进行大规模测序，节省了大量的时间和财力，而且无需进行繁琐的计算和排序工作。3、应用范围广。单侧PCR可以应用于已知部分RNA或DNA序列的基础上对其两端未知序列的测定。连接基因组DNA酶切位点粘性末端上的六或八个碱基的寡聚核苷酸(MBO，TAQ和MAE)以及LP引物，一次设计，长期可用于不同类型的序列测定。4、操作限制少。单侧PCR只要有50bp的已知序列就足够操作。相比之下，RACE要求已知300bp以上的长度。避免了RNA操作，减低了污染可能性。5、结果分析简便可靠。使用巢式引物，可以用内套引物P2进行特异性更强的扩增，从而提高了克隆的正确度和可靠性，提高工作效率。内套引物的3’端和未知待测序列间的一部分已知序列(一般在设计引物时预先留下15-100bp)可以用来验证所测得的DNA序列是否是目标序列，这种验证方法准确方便，实用性强。6、长度不限。基因组DNA的酶切是随机的，可以获得未知序列长达几Kb的序列，而且序列的准确性和真实性不会由于长度的增加而受影响。这是RACE方法所不能及的。7、操作对人员和环境无危害。不用构建Genomic库，所以避免了使用同位素。8、成本低。只相当于普通的PCR，无需昂贵的操作试剂盒。其中，半巢式PCR引物P1和P2，长度为15-25bp，P2比P1更靠近待测的未知序列部分，而且两者可以部分的重叠。P2的3’端距离待测序列要保留15-100bp，引物5’→3’方向为从已知DNA序列区域向待测定的未知DNA序列区域方向延伸。图2为已知DNA序列扩增的模板构建图示。图中的MBO处可以MBO或TAQ或MAE代替，和LP作用，形成部分双链的DNA结构，再和三种类型的同裂酶作用后形成的基因组DNA片断的粘端分别连接，构建形成三种模板，应用到后续的PCR中作为模板具体实施方式下面通过实施例进一步描述本专利技术。实施例1Lip I(Alkaline Lipase I，圆弧青霉PG37碱性脂肪酶I)基因启动子序列的扩增在已知Lip I DNA序列的基础上，采用本专利技术扩增Lip I基因的上游启动子DNA片段(启动子位于基因的上游位置)。首先根据已知序列设计合成了3’端引物P1和P2，P2靠近LipI的启动子端。TAQ5’-CGGCAC-3’和5’端连接处引物LP 5’-GGATCCCTTCACTCTCAAGTGC-3’，用识别位点为CCGG的限制性内切酶Msp1酶切PG37基因组DNA；然后将TAQ和LP在50℃加热5min，室温退火，再与PG37基因组DNA酶切产物在25℃连接12小时，就会在5’端的待测未知序列的Msp I酶切部位的粘性末端上连接上LP。以连接产物为模板，LP和P1为引物，PCR扩增Lip I的启动子片段。PCR扩增条件为10xPCR Buffer 5μl，无菌去离子水32μl，Taq酶(1U/μl)1μl，dNTP(1 mM)Mix 10μl，5’端引物LP(20pmol/μl)1μl，3’端引物P1(20pmol/μl)1μl，连接产物1μl。94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃45sec，共35循环；最后72℃延伸7min。扩增产物经2.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，纯化，再用LP和3’端内套本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种根据部分ＤＮＡ序列确定其两侧未知序列的方法，其特征在于通过对已知序列的限制性内切酶位点进行酶切，选择合适的ＰＣＲ引物，进行ＰＣＲ扩展，其具体步骤如下：（１）寡聚脱氧核糖核酸引物设计：根据已知序列设计半巢式ＰＣＲ引物，分别命名为Ｐ１和 Ｐ２，长度为１５－２５ｂｐ，Ｐ２比Ｐ１更靠近待测的未知序列部分，而且两者可以部分的重叠，Ｐ２的３’端距离待测序列要保留１５－１００ｂｐ；合成引物ＬＰ，３’末端的四个寡聚脱氧核糖核苷酸为ＧＴＧＣ，长度为１５－２５ｂｐ，表述如５’－ＸＸＸＧＴＧＣ－３’，其中的ＸＸＸ表示根据基因组ＤＮＡ的ＣＧ含量来设计的１１－２１ｂｐ长度的寡聚脱氧核糖核苷酸；再设计三种寡聚脱氧核糖核苷酸，分别命名为ＭＢＯ，ＴＡＱ和ＭＡＥ，序列为：ＭＢＯ：５’－ＧＡＴＣＧＣＡＣ－３’，ＴＡＱ： ５’－ＣＧＧＣＡ Ｃ－３’，ＭＡＥ： ５’－ＴＡＧＣＡＣ－３’（２）限制性内切酶的选择：根据对已知ＤＮＡ序列上的限制性内切酶酶切位点的分析，选用在已知序列上没有酶切位点的常用酶，或者选择在从Ｐ１到待测的未知序列之间没有酶切位点的酶，对基因组ＤＮＡ进行酶切 ，并与三种寡聚脱氧焦糖核苷酸作用；经与寡聚核苷酸作用后，抽提基因组ＤＮＡ，将基因组ＤＮＡ用根据上述原则确定的限制性内切酶作用０．５－１８小时后，纯化基因组ＤＮＡ片断；（３）ＰＣＲ模板构建：按照一定比例将寡聚脱氧核糖核苷酸ＭＢＯ或ＴＡ Ｑ或ＭＡＥ与ＬＰ作用，使ＬＰ与相应的碱基配对部分形成双链，再与基因组ＤＮＡ酶切后的产物在１２－２５℃用连接酶连接５－２４小时；（４）ＰＣＲ扩增：以步骤（３）中的产物为模板，以Ｐ１和ＬＰ为首轮ＰＣＲ引物，ＰＣＲ扩增待测的未知ＤＮＡ序列；扩 增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收，再用ＬＰ和Ｐ２进行ＰＣＲ扩增；对所得到的片段进行克隆和序列测定。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄伟达，王奕然，钱志康，邬敏辰，王维荣，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]