用于转基因油菜籽实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒制造技术

用于转基因油菜籽实时荧光ＰＣＲ检测的探针序列和试剂盒，给出检测转基因油菜籽Ｂａｒｎａｓｅ基因、修饰的ＣＰ４－ＥＰＳＰＳ基因、植物油菜籽ＦＭＶ３５Ｓ启动子和植物叶绿体内源基因的探针序列，最大、最小及优选序列，按探针序列制成的试剂盒，用于转基因产品定量检测和定性检测，具有灵敏度高、避免交叉污染造成假阳性的优点。本发明专利技术实时荧光ＰＣＲ技术采用完全闭管检测，无需ＰＣＲ后处理，避免了交叉污染和假阳性。该技术巧妙地运用了ＰＣＲ技术的ＤＮＡ高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，使得本方法具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因的扩增与检测。
技术介绍
随着转基因产品不断商品化，其安全性问题一直被世人关注，并不断发生争议。为了保障人类的身体健康，消除消费者顾虑，有利于国际贸易和商品流通，以欧盟为代表的很多国家，在经历了短暂的争议后，对此类特殊产品都制定出安全管理条例，以便严格管理。欧洲、日本等多国还制定了相应的限量法规。我国农业部也于今年出台了转基因产品的管理办法。然而，要使消费者了解或接受转基因产品，各项法规能得以实施，除了给以相关信息及增加透明度外，关键问题是能够有相应的科学检测方法来分析与鉴别传统产品与转基因产品。尤其面对国内外贸易中对转基因产品的限量要求，更应有相应的、准确地定量方法对转基因产品，尤其是转基因食品进行定性、定量检测。在目前国内外常用的转基因产品的检测方法中，主要是以核酸为基础的PCR检测方法。PCR方法又分为定性PCR和定量PCR方法。定性PCR，即聚合酶链式反应PCR已广泛应用于基于核酸的各个研究和临床诊断等领域，该方法使用两段(约17～20多个核苷酸)寡核苷酸作为反应的引物，这两段寡核苷酸引物的序列应不发生互补作用。但它们可和称为模板的待测DNA两条链上在一定的位点分别发生互补。反应液由包括含有镁离子的反应缓冲液、4种单核苷酸dNTP、模板DNA及引物。在DNA聚合酶催化下，通过温度的变化，DNA变性及退火，而合成两个互补位点之间的DNA片断。这样的反应反复进行，使第一个循环产生的DNA片断得以扩增。经25～30个循环，扩增倍数达106。用该方法检测转基因产品整个过程繁杂，操作步骤多，而且需要PCR后处理，如琼脂糖凝胶电脉和溴化乙锭染色，紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会，严重影响对结果的正确判断。
技术实现思路
本专利技术根据实时荧光定量PCR法原理，即是在定性PCR方法的基础上，加入了一条荧光标记的探针，收集记录荧光信号，从而可以检测出待测样品的初始拷贝数，判定待测油菜籽样品中是否含有转基因成份，从而确定待测油菜籽样品及其加工产品是否为转基因产品。本专利技术的技术方案是是在常规PCR检测基础上，添加了一条标记了两个荧光基团的探针。荧光报告基团(R)标记在探针的5′端，荧光淬灭基团(Q)标记在探针的3′端，两者可构成能量传递结构，即荧光报告基团所发出的荧光可被荧光淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告基团荧光信号增强。在PCR过程中，探针同PCR产物杂交，由于Taq酶具有5′到3′的外切酶活性，在引物延伸阶段将探针切断，荧光淬灭基团(Q)抑制作用消失，报告基团荧光信号增强。伴随PCR产物的增加，荧光信号随之增强，第n循环时的荧光信号增加值ΔRn等于Rn/Qn减去R0/Q0，Rn、R0分别为第n循环和PCR反应开始时的报告基团荧光值，Qn、Q0分别为第n循环和PCR反应开始时的淬灭基团荧光值。PCR反应的第3-15个循环的荧光值作为荧光本底信号，3-15个循环的ΔRn的标准偏差的10倍被设定为荧光阈值(threshold)，当信号达到该荧光阈值时的循环次数(Ct值)同PCR反应的初始模板量成正比。用于检测转基因油菜籽Barnase基因的探针序列是5’-agacgtcgctccggggaaaa-3’，该探针的最大序列是5’-ttgcagacgtcgctccggggaaaagcatcggcggaga-3’，该探针的最小序列是5’-gtcgctccgggg-3’。用于检测转基因油菜籽修饰的CP4-EPSPS基因的探针序列是5’-tgttccagaagaccgtgctc-3’，该探针的最大序列是5’-gaagggtgttactg ttccagaagaccgtgctccttctatgatcg-3’，该探针的最小序列是5’-ccagaagaccgt-3’。用于检测转基因植物油菜籽FMV35S启动子的探针序列是5’-ctccaaaccattagccaaaa-3’，该探针的最大序列是5’-ggtacagagtct ccaaaccattagccaaaagctacaggagat-3’，该探针的最小序列是5’-aaaccattagcc-3’。用于检测植物叶绿体内源基因的探针序列是5’-gcaatcctgagccaaatcc-3’，该探针的最大序列是5’-gcaatcctgagccaaatcc-3’，该探针的最小序列是5’-tcctgagccaaa-3’。按上述探针序列制成的用于转基因油菜籽实时荧光PCR检测的试剂盒。本专利技术的有益效果是通过检测作物本身所具有的内源参照基因(Endogenous Reference Gene)，如植物叶绿体，可以测定样品中转基因作物和非转基因作物的总DNA模板量；通过检测转基因作物中转入的外源基因，如油菜籽Barnase基因、油菜籽修饰的CP4-EPSPS基因等可以测定样品中转基因作物的DNA模板量，通过建立转基因作物标准参照样品的内源参照基因与外源基因Ct值之差(ΔCt)与转基因成分百分含量的标准曲线，可以计算出样品及其加工产品中转基因成分的百分含量。用于转基因产品定量检测的引物和探针也可以对转基因产品进行定性检测，具有灵敏度高、避免交叉污染造成假阳性的优点。本专利技术实时荧光PCR技术采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。该技术巧妙地运用了PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，使得本方法具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。附图说明图1为实时荧光PCR检测原理示意图。图2转基因产品实时荧光检测曲线图。(a)外源基因出现PCR扩增，(b)内源参照基因出现PCR扩增。图3非转基因产品实时荧光检测曲线图。(a)外源基因未出现PCR扩增，(b)内源参照基因出现PCR扩增。具体实施例方式实施例1用于转基因油菜籽实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒，检测转基因油菜籽外源基因(转基因成分)。检测基因Barnase基因。引物5’-ctgggtggcatcaaaagggaacc-3’、5’-tccggtctgaatttctgaagcctg-3’。探针5’-agacgtcgctccggggaaaa-3’。试剂盒应用该探针制成的用于检测转基因油菜籽的Barnase基因的试剂盒。实施例2用于转基因油菜籽实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒，检测转基因油菜籽外源基因(转基因成分)。检测基因修饰的CP4-EPSPS基因。引物5’-gacttgcgtgttcgttcttc-3’、5’-aacaccgttgagcttgagac-3’。探针5’-tgttccagaagaccgtgctc-3’。试剂盒应用该探针制成的用于检测转基因油菜籽修饰的CP4-EPSPS基因的试剂盒。实施例3用于转基因油菜籽实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒，检测转基因植物油菜籽外源基因(转基因成分)。检测基因FMV35S启动子。引物5’-aagcctcaacaaggtcag-3’、5’-ctgctcgatgttgacaag-3’。探针5’-ctccaaaccattagccaaaa-3’。试剂盒应用该探针制成的用于检测转基因植本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于转基因油菜籽实时荧光ＰＣＲ检测的探针序列，其特征是：用于检测转基因油菜籽Ｂａｒｎａｓｅ基因的探针的最大序列是：５’－ｔｔｇｃａｇａｃｇｔｃｇｃｔｃｃｇｇｇｇａａａａｇｃａｔｃｇｇｃｇｇａｇａ－３’，探针的最小序列是：５’－ｇｔｃｇｃｔｃｃｇｇｇｇ－３’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：覃文，曹际娟，
申请(专利权)人：覃文，曹际娟，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]