基因芯片分子探针及相关技术制造技术

本发明专利技术属于基因芯片应用技术领域，特别涉及到基因芯片的杂交，标记，洗脱，信号检测及数据分析技术。本发明专利技术提供一整套通过高聚物荧光微球、补骨脂素衍生物等进行的基因芯片杂交信号的特异性放大标记技术，该技术可以将基因芯片上的杂交信号扩大几个数量级以上，从而将杂交核酸的检测能力提升到单分子水平。本发明专利技术还提供了一种提高上述各反应过程中溶液和分子运动操纵效率的泳渗离子及溶液体系操纵技术以及用于高效屏蔽背景光或激发光噪音的表面等离子体共振激发技术。作为这些技术的一种最佳应用的组合－基因芯片分子探针有自动实现各反应过程的ＨＣＬ仪、ＨＣＬ试剂盒１９、基因芯片杂交室２和ＳＰＲ－ＣＣＤ信号检测及数据处理系统等几部分。其优势在于系统及其运行成本都很低、过程联合处理能力较高，操作简易，因而为基因芯片在临床诊断、工商及环境检疫、制药和国防等领域的普及应用提供了可行的技术条件。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因芯片应用
，特别是涉及到基因芯片的杂交，标记，洗脱，信号检测及数据分析技术。基因芯片是近几年来刚刚兴起的基因分析技术，它是利用平行分析原理将大量不同序列的核酸分子，作为分析样品中靶基因的基因探针，以高密度阵列的方式固化在硅片，玻璃，尼龙膜等基质上，从而制作成通常意义上的基因芯片，或称为基因微阵列，微方阵(1-2)。经过短短几年的迅猛发展，为了满足不同的市场需要，在平行分析思想的指导下，基因芯片已衍生出各种不同的表现形式，如美国Affymetrix公司(3)寡聚核苷酸芯片(4)，Genomic Solutions(5)公司，Incyte(6)公司，上海联合基因科技集团(7)等生产的玻璃基因芯片(8)，用于基因表达谱的研究(9)、疾病诊断与治疗、新药研究和环境保护(4，8)。由美国的Nanogen(10)，Aclara(11)，Motorola(12)等公司生产的实验室芯片(Lab-on-a-chips，)以及基因膜方阵等。上述各种芯片在集成度，特异性，灵敏度，过程自动化等诸多方面各有千秋。基因芯片应用技术发展到当今，作为最实用，最方便的一种，玻璃DNA芯片以其特异性，制造成本，规模或小批量基因芯片内容安排的灵活性与生产效率，从而为最广大的科研和工业界所采用，成为应用中的主流。这种基因芯片的制造技术已趋成熟，国内制造成本已可降低到普及化程度。我国已掌握了先进的优质基因芯片点阵技术，点制的基因芯片集成度可达每只基因芯片(18mm×36mm)16800个基因点，多种化学表面修饰(7)。而且这种基因芯片的标准化生产正逐渐在国际社会确立，其产品的批间稳定性和批内重复性已可得到很好控制。基因芯片向其最大的市场--临床诊断等实用领域一普及应用的大举挺进似乎已万事俱备，正蓄势待发。然而，从全球范围来讲，基因芯片在实用领域里的应用方面并没有像预想的那样乐观和迅速发展。综观各种形式的基因芯片应用系统，可以发现它们总在如下某个或若干方面的暴露出缺陷(1)基因芯片生化操作步骤繁杂，对操作人员的实验技术要求高在基因芯片使用中，基因分离，纯化，标记，PCR，杂交，洗脱，信号检测和数据处理等诸多复杂技术过程使得基因芯片仍然只有训练有素而且理论素养较高的专业科研人员才能掌握。而在广阔的实用领域，如医疗诊断，食品，药品等卫生检疫，法学鉴定等，一般从业人员难以达到专业科研人员的技术水平；(2)仪器和运行(指试剂盒，基因芯片等耗材价格)成本高；(3)检测灵敏度低，不能满足检测微量病毒和研究大量低丰度基因的实际要求等；(4)系统集成化，自动化程度低，多以单个功能产品形式出现，如检测仪，判读仪，杂交仪等，难以提高用户的时效和方便程度；(5)所采用的基因芯片存在各自的问题寡聚核苷酸芯片基因密度高但假阳性也高；芯片实验室功能集成度高，特异性好而密度太低，而且还不适合于规模标准化生产；玻璃基因芯片基因密度高，特异性好，适合规模标准化生产，而配套硬件系统的功能过程自动化程度低等等。综合分析一下，基因芯片在实用领域中的推广普及应用要求每一种基因芯片应用系统必须同时满足下面的所有必要条件(1)系统所采用的基因芯片必须特异性好，基因密度高，生产效率高，制造成本低，可实现标准化规模生产，并能达到足够高的稳定性和重复性，(2)系统本身必须功能集成度高，自动化程度高，操作简易，系统硬件及试剂盒成本低，介面友好，功能强大，技术性能稳定，(3)系统检测灵敏度必须达到足够高水平，可以满足绝8大多数用户的对分析灵敏度的要求，(4)最后，充足的基因资源是所有基因芯片及其面向各实用领域的配套处理系统挺进相应市场的先决条件(面向科研和制药工业的基因芯片系统除外)。除了最后一点依赖于人类基因组计划和后人类基因组计划的逐步完成之外，其他三个方面都是对基因芯片及其处理系统本身的要求。就本人的了解来看，在全球范围内，目前尚无任何一种基因芯片处理体系可以同时符合上述要求。因此，同时满足上述所有要求的基因芯片处理系统成为目前国际基因芯片
的首要之务，同时也是基因芯片事业发展的瓶颈所在。本专利技术的目的，从技术上讲，就是提供一套大幅度提升玻璃基因芯片检测灵敏度，经济实用性和可实现自动化运行的技术方法系统，并在最后提供一种实现上述功能的设备及试剂盒。其宗旨就在于提供基因芯片在社会各领域普及应用所需要的基础分子生物学处理，信号检测及结果分析系统，配套试剂盒及实用的基因芯片杂交室2。本专利技术率先在基因芯片处理技术中采用光学微粒(高分子荧光微球或含有大量荧光染料的高分子颗粒，硅氧光学磁珠，或通过任何其他手段将荧光染料，化学或生物发光物质等固定于微粒的表面或包埋于其内部等多种形式的高荷信号载体)作为标记物进行分子信号放大，具体方法可以如下(1)将光学微粒通过共价键连接特异性地标记到基因芯片表面已杂交的双链核酸分子上(2)或通过将样品中待分析的核酸连接到光学微粒上，用携带目标基因的光学微粒直接与基因芯片上的探针进行杂交，最后经过洗脱等过程后进行光学激发和信号检测。这种通过光学微粒的信号放大技术可以大大提高对基因芯片的检测灵敏度并降低其对高精度光学检测系统的要求，乃至通过零下10度到零下15度冷却CCD即可实现单分子检测的水平。再者，由于通过了信号放大，简化了基因芯片分子生物学的技术处理步骤，尤其是省去了DNA扩增的PCR过程，使整个过程可以通过温度，光和各种流体的程序化控制实现自动化，去除了各步骤人工操作带来的不确定性，同时也使实验人员从冗繁腻味的，程序性的，机械的操作中解放出来。更重要的是，该技术的采用还避免了由PCR技术过程给基因芯片分析本身所带来的特异性差，难以定量，技术操作难度大等致命问题。本专利技术还首度采用了表面等离子体共振(SPR)信号激发技术实现对背景光的完全屏蔽，提高信噪比，进一步改进了信号检测效果。本专利技术还在基因芯片的杂交，标记，洗脱等过程中全面引入了程序化交变电磁场作用，用于加快上述过程的效率，缩短过程所需时间。本专利技术的优势不仅在于提高了基因芯片检测灵敏度，处理时效，降低成本，同时还使非专业技术人员经过简短操作培训或指导，可以利用这种高度自动化的设备进行高水平和高效率的基因分析。这一切都为基因芯片的普及化应用提供了技术推动力。本专利技术从总体上分为1.基因芯片技术处理(杂交，标记，洗脱，光化反应等)系统-HCL仪及HCL试剂盒19部分，2.基因芯片光学检测(含新型基因芯片)和数据分析系统，3.基因芯片杂交室2，4.自动化全系统集成-GMPS基因芯片分子探针，5.智能芯片诊断用户介面，利用多元信号数据融合技术或多因素数据回归技术对临床诊断中基因芯片分子探针的工作原理本专利技术通过光学微粒作为高荷信号载体对基因芯片上杂交了的双链核酸进行特异性标记，从而实现信号放大。HCL仪是将基因芯片检测以前所要经过的杂交，标记，洗脱等前处理步骤实现自动操作及控制的设备，在HCL仪中运行的所有生化试剂及各种溶液统称为HCL试剂盒19。基因芯片经过HCL仪处理之后，将通过信号检测和数据分析系统才能最终得到我们所要的检测结果。加上最后两个部分合称基因芯片分子探针(GMPS)。下面就各个子系统进行分述。HCL试剂盒19HCL试剂盒19是整个GMPS基因芯片分子探针的核心。根据本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因芯片杂交信号放大标记技术，它是在基因芯片经过杂交过程之后，利用通式（Ⅰ）的化合物作为互补配对的核酸杂交双链特异性探针分子，而利用通式（Ⅱ）的化合物作为高荷信号载体对连接有探针分子的杂交双链核酸进行标记，通式（Ⅰ）的化合物结构特征 为：Ｐｓ－Ｌ↓［１］－Ａ，通式（Ⅱ）的化合物结构特征为：ＦＢ（－Ｌ↓［２］－Ａ’）↓［ｎ］，其中，Ｐｓ－表示补骨脂素（Ｐｓｏｒａｌｅｎ）、异补骨脂素以及它们的任何衍生物形式，它可以是４’－羟甲基－４，５’，８－三甲基补骨脂素（４’－ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ－４，５’，８－ｔｒｉｏｘａｌｅｎ，简写ＨＭＴ）、４’－胺甲基－４，５’，８－三甲基补骨脂素（４’－ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ－４，５’，８－ｔｒｉｏｘａｌｅｎ，简写ＡＭＴ）、三甲基补骨脂素（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｓｏｒａｌｅｎ，简写ＴＭＰ）、８－甲氧基补骨脂素（８－ｍｅｔｈｏｘｙｐｓｏｒａｌｅｎ，缩写为８－ＭＯＰ）、４，７，４’－和４，７，５’－三甲基异补骨脂素（４，７，４’－ａｎｄ４，７，５’－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｏｐｓｏｒａｌｅｎ）以及补骨脂素本身等，Ａ－和Ａ’－是指任何一对具有某种化学反应或相互作用特异性探针分子接头，它们可以是下列情况之一：（１）化学反应特异性功能团对；（２）免疫反应对；（３）其它形式的特异性分子识别相互作用对，－Ｌ↓［１］－和－Ｌ↓［２］－表示溶剂相容 性连接臂，即当溶剂为疏水体系时，连接臂亦为疏水连接臂；当溶剂为亲水体系时，连接臂亦为亲水连接臂，可以是ＰＥＧ、合成多肽等，ＦＢ表示以各种微小颗粒形式存在的高荷信号载体，它可以是高聚物荧光微球、表面修饰有荧光染料的硅氧磁珠、以及其它含高含 量荧光染料的载体，其表面修饰有可以与通式（Ⅰ）化合物中的探针分子接头Ａ－特异性反应的功能团或作用对Ａ’－，利用通式（Ⅰ）化合物处理基因芯片上杂交双链核酸的方法特征为：在杂交过程完成后，在－５０～１００摄氏度的温度条件下将含有通式（Ⅰ）化 合物浓度为０．００１ｍＭ～１０Ｍ的溶液导入基因芯片杂交室２中持续时间为２０个小时以内，在紫外光照下发生该化合物在核酸双链中的链间共价交联反应，从而实现其与双链核酸的特异性共价连接，利用通式（Ⅱ）化合物进行信号标记的方法特征为：在通式（Ⅰ ）化合物与双链核酸实现共价连接之后，导入含有通式（Ⅱ）化合物的溶液，持续１～１０００００秒时间，然后对非特异性吸附进行洗脱。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋克，
申请(专利权)人：宋克，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]