核酸的检测方法、样品的光学观察方法及荧光物质技术

一种简便地检测核酸的方法，不要求复杂的操作，例如在微观尺度流路内的液体的混合和清洗。提供了一种检测核酸的方法，包括以下步骤：使含核酸的样品与铜接触，并且检测从样品中发射的荧光。根据这种检测核酸的方法，仅通过将含核酸的样品与铜接触，就能简便地检测出源于核酸与铜的复合物的荧光。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸的检测方法、样品的光学观察方法及荧光物质
本技术涉及核酸的检测方法、样品的光学观察方法及荧光物质。更具体地，本技术涉及核酸的检测方法和样品的光学观察方法，两种方法都是基于从与铜接触的核酸中发出的荧光，以及包括铜和核酸的荧光物质。
技术介绍
近年来，在包括医疗领域、药物研发领域、临床检查领域、食品领域、农业领域、工程领域、法医学领域和刑事鉴定领域的多个领域中广泛开展利用核酸的技术研究。最近，技术开发了芯片实验室(lab-on-chip)，并且被实际应用于设置在微芯片中的微观尺度流路内进行核酸的染色、检测、扩增等。作为检测核酸的基本技术，有一种采用荧光颜料染色核酸的方法。已知许多荧光颜料，例如hoechst33342、DAP1、溴化乙锭、SYBR绿等。举例来说，hoechst33342和DAPI在流式细胞仪或显微镜中用于细胞或组织中的核酸染色。溴化乙锭常常用于对电泳中的核酸分子染色。SYBR绿等也被用于在例如聚合酶链反应的核酸扩增技术中，实时检测核酸的扩增过程。与本技术相关，通常已知的在荧光观察时由细胞显示的自发荧光将被描述。荧光之一是在铜存在的条件下，由紫外光照射的细胞所显示的橙色的自发荧光。例如，据报道当加入铜时，果蝇幼虫中肠内的特定部位的细胞发射橙色荧光(参照非专利文件I至8)。在果蝇幼虫中肠内，观察到特别强烈橙色荧光的细胞被称之为“铜细胞”等。据报道，当所加入铜的浓度增加时，在铜细胞周围的细胞(参照非专利文件4)以及幼虫的整个体壁(参照非专利文件2)观察到荧光。描述了在细胞的细胞质和细胞核都可观察到上述的橙色荧光，并且，尤其是在细胞质的颗粒中被显著检测到(参照非专利文件2 4，7)。描述了荧光的波长范围是590nm 630nm之间，峰值波长是610nm，且最大激发波长是340nm (参照非专利文件3)。对于除果蝇外的有机体，具有相似性质的自发荧光也被观察到。例如，有报道在大鼠实验中，通过紫外光激发(激发波长是310nm)，在给铜的个体肝脏中观察到橙色荧光(具有605nm的峰值波长)(参照非专利文件9)。此外，有报道在随着年龄增长在肾脏和肝脏中积累了铜的模型大鼠的肾脏中观察到类似的荧光(参照非专利文件10)。同样，有报道在酵母(参照非专利文件11)和 Wilson病患者的人体肝脏组织(参照非专利文件12)中观察到具有相似特征的自发荧光。Wilson病是一种铜排泄不足并且在肝脏细胞中积累铜的遗传疾病。推测铜和金属硫因(MT)的复合物(在下文中简写为“Cu-MT”)为上述的发射橙色荧光的荧光物质(参照非专利文件14 23)。Cu-MT具有诸如非专利文件13中的305nm的激发波长和565nm的荧光波长，及非专利文件17中的310nm的激发波长和570nm的荧光波长的波长特性。可以想到的是，Cu-MT包含一价铜离子(Cu (I))(参照非专利文件13、15、17,19 和 23)。通过嘧啶或硫醇盐与铜相互作用而发射荧光的含嘧啶或硫醇盐的复合物作为含铜的荧光物质而广为人知(参照非专利文件24 29)。另一方面，过去已研究了各种金属离子与核酸的相互作用。例如，已知当单价铜离子与核酸相互作用时，细胞核中包含的少量铜使核酸结构稳定，但是在过氧化氢共存下，细胞核中包含的少量铜使DNA受损(参照非专利文件30)。还有报道，与铜的相互作用改变了DNA的吸收光谱(参照非专利文件30和31)。此外，据报道，吸收光谱的改变依赖于DNA的碱基序列(具体地，具有G-C对的高分子及含A-T对的高分子)(参照非专利文件30)。引文列表非专利文件非专利文件 I ；Physiological genetic studies on copper metabolism in thegenus Drosophila.(1950)Genetics35，684-685非专利文件2 !Organization and function of the inorganic constituents ofnucle1.(1952)Exp.Cell Res.，Suppl.2:161-179非专利文件 3:Ultrastructure of the copper-accumulating region of theDrosophila larval midgut.(1971)Tissue Cell.3, 77-102非专利文件4 !Specification of a single cell type by a Drosophilahomeotic gene.(1994)C ell.76，689-702非专利文件5:Two different thresholds of wingless signalling withdistinct developmental consequences in the Drosophila midgut.(1995)EMBOJ.14，5016-5026非专利文件6:Calcium-activated potassium channel gene expression in themidgut of Drosophila.(1997) Comp.Biochem.Physiol.B Biochem.Mol.Biol.118, 411-420非专利文件 7 !Evidence that a copper-metallothionein complex isresponsible for fluorescence in acid-secreting cells of the Drosophila stomach.(2001)Cell Tissue Res.304，383-389非专利文件8:Peptidergic paracrine and endocrine cells in the midgut ofthe fruit fly maggot.(2009)Cell Tissue Res.336，309-323非专利文件9:A luminescence probe for metallothionein in liver tissue:emission intensity measured directly from copper metallothionein induced in ratliver.(1989)FEBS Lett.257，283-286非专利文件 10:Direct visualization of copper-metal lothionein in LECrat kidneys -application of autofluorescence signal of copper—thiolate cluster.(1996)J.Histochem.Cytochem.44，865-873非专利文件 11 !Incorporation of copper into the yeast Saccharomycescerevisiae.1dentification of Cu(I)—metallothionein in intact yeast cells.(1997)J.1norg.Bioche本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：新田尚，
申请(专利权)人：索尼公司，
类型：
国别省市：