本发明专利技术涉及基因多态性检测芯片，公开了一种恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性检测芯片，该芯片包括固相载体和探针，所述探针与待测恶性疟原虫药物抗性相关基因的核苷酸序列和／或其互补序列进行杂交。本发明专利技术还公开了所述芯片用于检测恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性的方法。本发明专利技术的检测芯片能同时进行多种恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性的检测，可用于恶性疟原虫药物抗性相关分子标志的现场监测，以快速掌握恶性疟流行区的多种药物抗性产生情况，指导治疗方案的调整，从而提高恶性疟防治效果，减轻该病造成的社会、经济负担。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及疟原虫抗性相关基因多态性检测芯片，尤其涉及一种恶性疟原虫药物 抗性相关基因多态性检测芯片及其应用。技术背景恶性疟在世界范围内流行形势严峻，每年约100万人死于恶性疟，尚不包括间接 引起的死亡。我国疟疾防治取得显著成就，但疟疾仍然是我国最重要的寄生虫病之一， 且云南和海南仍然存在恶性疟流行，历年均有死亡病例报告。恶性疟对流行地区造成 严重的社会经济负担，药物抗性的产生进一步加重其危害。20世纪50年代后期在泰 缅边境和哥伦比亚出现氯喹抗性病例。随后，氯喹抗性几乎遍布恶性疟流行区，哌喹、 甲氟喹、乙胺嘧啶和磺胺类药物抗性株相继出现，甚至青蒿素类药物的敏感性也开始 下降。研究结果表明我国也存在较为严重的恶性疟原虫抗性问题，呈现以下趋势抗 一种药物一抗多种药物，低度抗性一高度抗性，单一抗性一多重抗性，产生抗性慢一 产生抗性快。深入理解恶性疟抗性的产生机制，准确快速监测抗性株的分布和流行已 成为当前恶性疟防治工作面临的重要问题。近期研究表明抗疟药抗性的产生与恶性疟原虫某些关键基因的单核苷酸多态性 (Single Nucleotide Polymorphism, SNP)有关，目前发现多个基因的SNP可反映 恶性疟原虫对相应药物的抗性情况，并在不同地区的多项研究中得到验证。已明确的 恶性疟原虫抗性相关SNP包括:恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因(Pfcrt)的391T/A、 392 G/C、 399 G/T、 400 A/G、 402 T/A和404 A/C多态性(对应72 76位氨基酸编 码序列)与氯喹抗性相关联(Anderson TJ， Nair S, QinH， et al. Antimicrob Agents Chemother, 2005， 49 (6) :2180-2188; Tagelsir N， Ibrahim Z, Medani A， et al. Acta Trop， 2006， 97 (1) :19-25; Dittrich S, Alifrangis M, Stohrer JM， et al. Trop Med Int Health, 2005, 10(12) : 1267-1270);恶性症原虫多药抗性基因(Pfmdrl) 的256 A/T和257 A/T多态性(对应86位氨基酸编码序列)与甲氟喹、氯喹等多种 药物的抗性有关(Anderson T丄Nair S， QinH, et al. Antimicrob Agents Chemother,2005, 49 (6) :2180— 2188; Tagelsir N， Ibrahim Z， Medani A, et al.Acta Trop，2006, 97 ( 1 ) :19-25; Duraisingh MT， Refour P. Mol Microbiol, 2005， 57(4) :874-877);恶性疟原虫二氢喋酸合成酶基因(Pfdhps)的1482 T/G、 1483 C/T/G、 1486 G/C、 1794 A/G、 1918 C/G和2013 G/T/A多态性(对应436、 437、 540、 581 和613位氨基酸编码序列)与磺胺类药物抗性有关；恶性疟原虫二氢叶酸还原酶基因(Pfdhfr)的148 T/C、 152 A/T、 153 T/C、 175 T/C、 323 G/A/C和490 A/T多态性(对应50、 51、 59、 108和164位氨基酸编码序列)与乙胺嘧啶抗性有关(官亚宜，汤 林华.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2005, 23 (2) :117-120; Ha卯i CT， Gbotosho GO, Folarin OA, et al. Acta Trop， 2005, 95 (3) :183-193; Ndiaye D, Daily JP， Sarr 0， et al. Trop Med Int Health, 2005， 10 (11) :1176-1179);恶性疙原虫 三磷酸腺苷酶第6亚基基因(PfATPase6)的2306 G/A多态性(对应769位氨基酸编 码序列)与青蒿素类药物IC50升高有关(JambouR， Legrand E， NiangM， et al. Lancet, 2005, 366 (9501) :1960-1963; Eckstein-Ludwig U， Webb RJ， Van Goethem ID， et al. Nature, 2003， 424 (6951) : 957-961)。在非洲和东南亚等恶性症严重流行地 区，上述SNP已被作为分子标志用于现场恶性疟原虫的药物抗性评价(官亚宜，汤林 华.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2005, 23(2): 117-120;CongpuongK， Na Bangchang K， Mungthin M, et al. Trop Med Int Health, 2005， 10 (8) :717-722; Syafruddin D, Asih PB， Casey GJ， et al. Am J Trop Med Hyg， 2005， 72 (2) :174-181; Nsimba B, Jafari- Guemouri S, Malonga DA， et al. Trop Med Int Health. 2005， 10(10) :1030-1037)。为找到一种高效、便捷的检测这些抗性分子标志的手段，国内外学者开展了大量 研究，运用各种分子生物学技术，已建立起以下几种方法。(1) 突变特异性PCR (mutation-specific PCR)，该方法利用PCR引物的3，端 末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计突变特异性PCR扩增引物， 在严格的条件下，只有在引物3'碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测 出突变。Djimde等运用该技术检测了 pfcrt氨基酸76位点的突变情况(Djimde, A.， 0. K. Doumbo， J. F. Cortese， et al. N Engl J Med. 2001， 344:257—263)。(2) 巢式PCR-RFLP，巢式PCR是指利用两对PCR引物对模板DNA进行两轮PCR 扩增反应。在第一轮扩增中，外侧引物扩增出第一轮产物，再以此产物作为内侧引物 模板，进行第二轮扩增。接下来，对第二轮扩增产物进行限制性酶切反应，根据酶切 产物的电泳图谱，确定标本基因型。Djimde等设计了 pfcrt和pfmdrl基因多态性的巢式PCR-RFLP检测方法，用于检测pfcrt氨基酸76位点和pfmdrl氨基酸86位点的 SNP (Djimde, A., 0. K. Doumbo， J. F. Cortese， et al. N Engl J Med. 2001， 344:257-263)。(3) 巢式PCR-DNA测序，首先对模板DNA进行巢式PCR扩增，再对第二轮PCR 产物进行测序，将测序结果与参考序列比对，确定待测标本的基因型。该方法被认为 是目前最为可靠的检测方法，常用于评价其他检测方法的准确性。(4) 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性检测芯片，包括固相载体和探针，其特征在于，所述探针与待测恶性疟原虫药物抗性相关基因的核苷酸序列和／或其互补序列进行杂交。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张国庆，汤林华，官亚宜，武松，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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